桂林市售（用）腌菜亞硝酸鹽含量及其細菌豐富度檢測

◎ 陳玉怡，廖英琛，廖 睿，嚴金琳，陸祖軍

（廣西師范大學生命科學學院，廣西 桂林 541006）

腌菜歷來是我國居民喜愛的配菜和開胃品。隨著對腌菜抗菌、抗癌、抗衰老以及減肥等保健功能的認識[1]，腌菜產業飛速發展，形成了“小產品、大市場”的格局[2]。腌菜一般采用自然厭氧發酵生產，產品的亞硝酸鹽含量、微生物種類組成和豐度成為腌菜質量的重要指標，也是消費者、學者的關注點。生書晶報道韓國泡菜中的乳酸菌達30多種[3]。張宗舟等對泡菜生產過程中的微生物進行區系分析，證實泡菜發酵是一種特殊的混菌共酵，乳酸菌、醋酸菌起主要作用，丁酸菌、酵母菌起輔助作用[4]。

桂林市地處東經 109°36′50″～ 111°29′30″，北緯24°15′23″～ 26°23′30″，屬亞熱帶季風氣候。當地居民尤其偏愛作為腌菜，市售產品主要由當地廠家、作坊生產，但至今尚無桂林市售腌菜產品的安全質量狀態研究和報道。本項目用鹽酸萘乙二胺分光光度法測定桂林市售腌菜產品的亞硝酸鹽含量，以高通量測序法對其細菌多樣性進行系統分析，旨在為桂林在售（用）腌菜的安全性評價提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

以包裝方式（袋裝、罐裝、散裝）為樣品選取主依據，各目標包裝方式下隨機選取6種產品共18個樣品（見表1）。對全部樣品進行亞硝酸鹽測定，用高通量測序技術檢測9個樣品的細菌及豐度。

表1 醬腌菜樣品基礎信息表

1.2 亞硝酸鹽含量測定

1.2.1 試劑

飽和硼砂溶液；106 g·L-1亞鐵氰化鉀水溶液；磺胺溶液（磺胺1 g+25 mL濃鹽酸，加蒸餾水稀釋至100 mL）；萘胺溶液（0.1 g萘胺+0.5 mL濃鹽酸，加蒸餾水稀釋至50 mL）；220 g·L-1乙酸鋅水溶液

1.2.2 儀器和設備

TU-1810SPC 紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；YP5002 電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2.3 步驟

檢測步驟參照國家標準（GB 5009.33-2016）[5]。

取50 g樣品，加蒸餾水至200 mL，勻漿；取50 mL勻漿，用80 ℃的溫水洗入250 mL錐形瓶，加入6.5 mL飽和硼砂溶液，搖勻；沸水浴30 min，取出錐形瓶置于冷水中冷卻至室溫；加1 g碳粉，2 mL亞鐵氰化鉀溶液，2 mL乙酸鋅于錐形瓶中，振搖3～5 min，調節pH1～2，用二次蒸餾水定容至250 mL，搖勻；分裝到3支膠管中離心（2 500 r·min-1，10min）；取3支試管分別加入2 mL樣液上清，4 mL磺胺，搖勻后放置5 min，加入4 mL萘胺；反應30 min，于520 nm處進行紫外分光光度測定；每個樣品同時測定3份，結果用“平均值±標準差”表示。

1.3 細菌種類多樣性及其豐度測定

選取18個樣品中的9個樣品進行高通量測序。提取樣品總DNA后，將細菌16 S rDNA （V3+V4）區域 引 物（338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'、806R：5'- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3） 末 端 加上測序接頭，進行PCR擴增，并對其產物進行純化、定量和均一化，形成測序文庫。測序文庫質量檢測合格后用Illumina HiSeq 2500進行測序。

2 結果與分析

2.1 腌菜亞硝酸鹽含量測定結果

18個腌菜樣品中亞硝酸鹽含量測定結果見表2。

表2 18個樣品亞硝酸鹽含量及其含水量表

由表2可知，散裝樣品的亞硝酸鹽含量平均值最低，其次是袋裝，最高者為罐裝。罐裝的醬香木瓜（G06）亞硝酸鹽含量為（25.67±0.56）mg·kg-1，超過了國家醬腌菜食品安全標準20 mg·kg-1。

2.2 細菌多樣性

2.2.1 UPGMA分析

Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean是一種常用非加權組平均聚類分析方法，可為樣品層次聚類，結果如圖1、圖2。

圖1 非加權組平均聚類圖

圖2 加權組平均聚類圖

圖1的分析結果顯示，在不同時考察物種有無及豐度時，同種包裝的細菌物種的類型相似。在同時考察物種有無和豐度時（圖2），散裝腌菜的細菌物種的類型相似性沒有變化，罐裝與袋裝者的細菌物種類型發生了變化。

2.2.2 樣品各分類等級物種統計分析

表3為樣品各分類等級物種統計表，顯示了9個腌菜樣品細菌各分類等級物種類型數目。

表3 樣品各等級物種統計表

除界、門之外的其他5個層級，袋裝樣品所含細菌種類數量最多，罐裝次之，散裝樣品最少。

2.2.3 物種分布

圖3、4分別為樣品細菌群落屬、門水平物種分布比例。一種顏色代表一個物種，色塊長度表示物種所占相對豐度比例；為使視圖效果最佳，只顯示豐度水平前十的物種，并將其他物種合并為 Others 在圖中顯示，Unclassified代表未得到分類學注釋的物種。

圖3 屬水平物種分布圖

圖 4 門水平物種分布圖

在屬水平上（圖3），檢測的9個腌菜樣品的優勢微生物為乳桿菌屬（Lactobacillus）、不動桿菌屬（Acinctobacter）、弓（形）桿菌屬（Arcobacter）、短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、酸桿菌屬（Acctobacter）、大腸桿菌志賀菌（Escherichia-Shigella）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。以蔬菜食材、食鹽、飲用水為主要材料的腌菜（罐裝品味鮮老壇豇豆（G03）、袋裝鄧仕魚酸菜（D03）、散裝的酸筍（S01）和酸菜（S03））其乳酸菌屬占69.24%～97.89%。散裝藠頭（S02）細菌種類最多，達9類。從門水平（圖4）看，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）是檢測的9個樣品中優勢菌群，它們為好氧或兼性細菌。

2.2.4 樣品亞硝酸鹽含量與其細菌物種豐富度相關性

Alpha多樣性反映的是單個樣品物種豐富度及物種多樣性；Chao1和Ace指數衡量物種豐富度即物種數量的多少；Shannon和Simpson指數用于衡量物種多樣性受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響，Shannon指數越大，Simpson指數越小，說明樣品的物種多樣性越高。OTU的覆蓋率反映本次測序結果是否代表了樣本中微生物的真實情況，覆蓋率越高，則樣本中物種被測出的概率越高。本項目使用Mothur（version v.1.30）軟件進行樣品的Alpha多樣性指數統計和評估，結果如表4。

表4 AIpha多樣性指數與樣品亞硝酸鹽含量的比較表

將表中的樣品亞硝酸鹽含量（干重）與Simpson指數進行相關性分析，其相關系數為0.554 7，呈正相關關系，隨著樣品亞硝酸鹽含量增加，其細菌多樣性的降低（如表5）。

表5 AIpha多樣性指數值與樣品亞硝酸鹽含量相關性分析表

3 討論

3.1 亞硝酸含量分析

國家標準（GB 5009.33-2016）規定，醬腌菜的亞硝酸鹽含量不得超過20 mg·kg-1（濕重）。所檢測的桂林市在售（用）18個腌菜產品中只有罐裝木瓜（G06）的亞硝酸鹽含量為（25.67±0.56）mg·kg-1（濕重），超標28.4%，超標樣品是樣品總數的5.56%。新疆維吾爾自治區食品藥品監督檢驗所檢測的蘿卜和白菜兩類泡菜14個樣品中有9個樣品的亞硝酸鹽含量超標，超標率為64.3%[6]；蘭州市、白銀市、通渭市的198份醬腌菜超標率為5.56%[7]。江蘇省沭陽縣市場銷售散裝、袋裝的4個鹽腌菜產品共423份發現超標率為4.26%[8]。從亞硝酸含量角度，桂林市在售（用）腌菜還是相對比較安全的。

亞硝酸鹽的積累是泡菜生產及儲備過程中的常見問題。本研究中不同包裝類型的腌菜亞硝酸鹽含量不同，散裝者平均值最低，其次是袋裝，最高者為罐裝。此可能與其制備、出售時的密封程度及產品內硝化菌等好氧菌豐度有關，因為溶解氧濃度與硝化酶（由硝化菌等好氧菌產生）活性對亞硝酸降解起決定作用[9]；但本研究中硝化菌并不是是任何一個樣品的優勢菌群，證明研究對象在制備過程及貨架期內滿足厭氧條件（密閉性），或有氧條件（對于散裝腌菜）是短暫的。厚壁菌門的乳酸菌類群代謝過程中產生乳酸引起低pH值，在亞硝酸鹽酸降解過程中起關鍵作用[10]。因此本研究中不同包裝腌菜的亞硝酸鹽含量（濕重）差異，可與乳酸菌群及其厭氧產酸量（或者濃度）有關。

3.2 細菌多樣性分析

隨機抽取18個樣品中的9個，進行高通量測序，檢測其中細菌多樣性，結果顯示，除界、門之外的其他5個層級，袋裝樣品所含細菌種類數量最多，罐裝次之，散裝樣品最少，是否與產品生產過程及包裝方式的無氧程度及無氧時間長短有關，有待進一步研究。散裝腌菜為當地工廠或作坊生產，一直處于完全浸泡狀態，售出時點離出廠時點不超過6 h，有的甚至是出售時仍處于厭氧發酵條件，因此受雜菌污染的概率較低。

3.3 食材對細菌豐富度的影響分析

本研究對象中厚壁菌門、變形菌門為優勢門。除了藠頭（S02，石蒜科植物），以其他食材制備的腌菜乳酸菌屬占69.24%～97.89%，以禾本科和十字花科植物（如竹筍、芥菜）為發酵底物者，乳酸菌屬占比最高。乳酸菌厭氧條件下發酵產酸抑制非耐酸菌群如許多致病菌和腐敗菌的生長，是腌菜保質、提高風味的重要因素[11]。禾本科和十字花科植物腌制時乳酸菌屬占比最高，證明此食材最合適乳酸菌屬細菌的生長，其泌酸抑雜菌的能力最強，對條件致病性細菌，如本研究中優勢菌群不動桿菌屬、弓（形）桿菌屬、克雷伯菌屬以及大腸桿菌志賀菌（圖3）有較強的抑制作用；所以，從此角度分析，禾本科和十字花科植物食材（如竹筍、芥菜）腌制的菜品，直接食用時比其他菜品相對安全；石蒜科植物食材如藠頭（S02）腌菜存在較高比例的條件致病性細菌，如不經高溫滅菌即食用，有較高被感染致病病原菌的風險。