超高效液相色譜質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)量不確定度評(píng)定

◎ 肖聰偉

（江西省食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，江西 南昌 330001）

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Waters Xevo?TQ-S超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、Buchi R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、Organomation N-EVAP氮吹儀、Sartorius QUINTIX124-1CN電子天平。

1.2 樣液制備

本試驗(yàn)選取市場(chǎng)購(gòu)買草魚作為試驗(yàn)樣品。稱取5.00 g已搗碎樣品于50 mL離心管中，加入200 μL內(nèi)標(biāo)溶液，加入11 mL乙腈提取，超聲振蕩提取2 min，8 000 r·min-1勻漿提取 30 s，4 000 r·min-1離心 5 min，吸取上清液，殘?jiān)偌尤?1 mL乙腈重復(fù)提取1次，合并上清液，并用乙腈定容至25 mL。取出其中5 mL過中性氧化鋁柱，收集流出液，用4 mL乙腈洗脫，收集合并洗脫液和流出液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用1.0 mL 5 mmol·L-1乙酸銨溶液定容2 mL，樣液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后供UPLC-MS/MS進(jìn)樣分析。

儀器測(cè)定條件參照GB/T 19857-2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定》中內(nèi)容設(shè)置，試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用陰性樣品加標(biāo)試驗(yàn)來評(píng)定方法的測(cè)量不確定度。

1.3 計(jì)算公式

試樣中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫的含量均按公式（1）進(jìn)行計(jì)算。

式（1）中，X表示試樣中目標(biāo)物的含量，單位為μg·kg-1；C表示樣液中目標(biāo)物的濃度，單位為ng·mL-1；V表示被測(cè)液定容體積，單位為mL；M表示樣品質(zhì)量，單位為g；f表示稀釋因子。

2 測(cè)量不確定度的來源分析及測(cè)量數(shù)學(xué)模型的建立[1]

被測(cè)組分含量的測(cè)定測(cè)量不確定度來源如圖1所示，包括以下5個(gè)方面：①樣品稱量質(zhì)量引入的測(cè)量不確定度。②樣品定容體積引入的測(cè)量不確定度。③樣品提取液測(cè)定濃度引入的測(cè)量不確定度。包括采用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求得樣品濃度過程中所引入的測(cè)量不確定度、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制備引入的測(cè)量不確定度。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制備過程中的測(cè)量不確定度由標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)量不確定度、天平的允差、容量瓶體積的測(cè)量不確定度組成。④平均回收率引入的測(cè)量不確定度。⑤測(cè)試過程中因?qū)嶋H操作引入的測(cè)量不確定度，由重復(fù)進(jìn)行的加標(biāo)樣品的精密度和準(zhǔn)確度來體現(xiàn)。測(cè)量不確定度來源因果圖見圖1。

圖1 測(cè)量不確定度來源因果圖

3 測(cè)量不確定度評(píng)定[2-4]

3.1 樣品稱量質(zhì)量引入的測(cè)量不確定度

稱取樣品質(zhì)量的測(cè)量不確定度主要來源于天平校準(zhǔn)和稱量中的重復(fù)性。天平校準(zhǔn)所引入的測(cè)量不確定度為±0.2 mg，采用矩形分布處理，其標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度為：

每個(gè)樣品測(cè)試稱取2平行樣，由于涉及樣品的兩次獨(dú)立稱量，因此天平稱量產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度為：

3.2 定容體積引入的測(cè)量不確定度

樣品定容體積的測(cè)量不確定度主要由移液管的校準(zhǔn)和溫度變化引起。

3.2.1 移液管的校準(zhǔn)引入的測(cè)量不確定度

在操作步驟中定容使用到1 mL的移液器。根據(jù)計(jì)量校準(zhǔn)證書給出的校準(zhǔn)技術(shù)指標(biāo)，1 mL移液器在20 ℃時(shí)容量相對(duì)誤差u1(V)2=0.1%（0.001 mL），重復(fù)性偏差u2(V)2=0.6%（0.006 mL）。

3.2.2 溫度變化引入的測(cè)量不確定度

實(shí)驗(yàn)室的溫度控制在（20±4）℃范圍內(nèi)，溫度變化引入的測(cè)量不確定度按矩形分布處理，其標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度為：

1 mL移液器引入的體積測(cè)量不確定度：

由于定容過程使用3次移液器，則體積測(cè)量不確定度：

合成上述測(cè)量不確定度分量，則樣品定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度為：

3.3 樣品提取液濃度計(jì)算引入的測(cè)量不確定度

3.3.1 校準(zhǔn)曲線擬合

利用校準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中目標(biāo)物的含量。使用配制的100 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋兩個(gè)梯度級(jí)別后，配制5個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液，其濃度分別為 1、2、5、10、20 ng·mL-1，每個(gè)濃度分別測(cè)定 1次，使用線性最小二乘法以色譜峰面積對(duì)待測(cè)物濃度進(jìn)行線性擬合，得到線性方程分別為：孔雀石綠Y=0.853683C-0.224836，結(jié)晶紫Y=3.01321C-0.235291，隱性孔雀石綠Y=1.16301C-0.472361，隱性結(jié)晶紫Y=0.31629C-0.242142，5個(gè)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)量結(jié)果見表1。

表1 不同濃度下的響應(yīng)值表

3.3.2 樣品提取液濃度測(cè)定引入的測(cè)量不確定度

3.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合測(cè)量不確定度

對(duì)陰性樣品按加標(biāo)量10.0 ng·g-1分別進(jìn)行3次加標(biāo)試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果平均值為：孔雀石綠4.988 ng·mL-1；結(jié)晶紫 4.741 ng·mL-1；隱色孔雀石綠 5.093 ng·mL-1；隱色結(jié)晶紫5.074 ng·mL-1，由校準(zhǔn)曲線所帶來的測(cè)量不確定度可由式（2）計(jì)算。

式（2）中，u1(C)表示待測(cè)溶液濃度C的測(cè)定測(cè)量不確定度；S表示殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差；C表示樣品加標(biāo)后檢測(cè)平均值；表示不同標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的平均值（共測(cè)量n次）；B1表示擬合曲線中的斜率；P表示樣品平行的測(cè)定次數(shù)；n表示標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定的次數(shù)；Scc示離均差平方和。

其中：

孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色孔雀石綠和隱色結(jié)晶紫的殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差和離均差平方和計(jì)算見表2～5。

因此，校準(zhǔn)曲線擬合計(jì)算中各參數(shù)匯總見表6。

表2 孔雀石綠的殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差和離均差平方和表

表3 結(jié)晶紫的殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差和離均差平方和表

表4 隱色孔雀石綠的殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差和離均差平方和表

表5 隱色結(jié)晶紫的殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差和離均差平方和表

表6 校準(zhǔn)曲線擬合計(jì)算中各參數(shù)匯總表

3.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和中間使用液濃度測(cè)量不確定度

實(shí)際測(cè)量過程中，標(biāo)準(zhǔn)使用液配制如下：利用校準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中孔雀石綠等的含量。使用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（濃度偏差為0.05%）分稀釋兩次配制5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

配制過程中，由于稀釋產(chǎn)生的測(cè)量不確定度遠(yuǎn)小于標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合所帶入的測(cè)量不確定度，因此將此類測(cè)量不確定度忽略不計(jì)。

因此，樣品提取液測(cè)量濃度引入的測(cè)量不確定度為：

3.4 儀器精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度u′（精密度）

用5 ng·mL-1的標(biāo)品，重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積數(shù)據(jù)及RSD見表7。

表7 重復(fù)性測(cè)試體現(xiàn)儀器的精密度表

3.5 測(cè)定過程準(zhǔn)確度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度u′（準(zhǔn)確度）

對(duì)3個(gè)樣品分別進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，體現(xiàn)測(cè)定方法過程準(zhǔn)確度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度，加標(biāo)結(jié)果回收率見表8。

表8 加標(biāo)回收測(cè)試體現(xiàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度表

孔雀石綠：

準(zhǔn)確度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度：

結(jié)晶紫：

準(zhǔn)確度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度：

隱色孔雀石綠：

準(zhǔn)確度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度：

隱色結(jié)晶紫：

準(zhǔn)確度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度：

4 合成標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度及擴(kuò)展測(cè)量不確定度

4.1 孔雀石綠的合成標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度及擴(kuò)展測(cè)量不確定度計(jì)算

孔雀石綠的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度分量見表9。

表9 孔雀石綠的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度分量匯總表

根據(jù)：

則合成測(cè)量不確定度為：

一般情況下，按照慣例，測(cè)量結(jié)果的擴(kuò)展測(cè)量不確定度取包含擴(kuò)展因子k，則擴(kuò)展測(cè)量不確定度：Urel=k×u'(x)。

在95%置信概率下，k=2，因此，擴(kuò)展測(cè)量不確定度U=0.925×2=1.85 μg·kg-1，則樣品中孔雀石綠含量的測(cè)量結(jié)果應(yīng)表示為χ=(9.976±1.85)μg·kg-1。

4.2 隱色孔雀石綠的合成標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度及擴(kuò)展測(cè)量不確定度計(jì)算

隱色孔雀石綠的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度分量見表10。

表10 隱色孔雀石綠的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度分量匯總表

根據(jù)：

則合成測(cè)量不確定度為：

在95%置信概率下，k=2，因此，擴(kuò)展測(cè)量不確定度U=0.776×2=1.550 μg·kg-1，則樣品中隱色孔雀石綠的含量測(cè)量結(jié)果應(yīng)表示為χ=(10.186±1.550)μg·kg-1。

4.3 結(jié)晶紫的合成標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度及擴(kuò)展測(cè)量不確定度計(jì)算

結(jié)晶紫的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度分量見表11。

表11 結(jié)晶紫的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度分量匯總表

根據(jù)：

則合成測(cè)量不確定度：

在95%置信概率下，k=2，因此，擴(kuò)展測(cè)量不確定度U=0.451×2=0.902 μg·kg-1，則樣品中結(jié)晶紫含量測(cè)量結(jié)果應(yīng)表示為χ=(9.482±0.902)μg·kg-1。

4.4 隱色結(jié)晶紫的合成標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度及擴(kuò)展測(cè)量不確定度計(jì)算

隱色結(jié)晶紫的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度分量見表12。

表12 隱色結(jié)晶紫的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度分量匯總表

根據(jù)：

則合成測(cè)量不確定度為：

在95%置信概率下，k=2，因此，擴(kuò)展測(cè)量不確定度U=0.398×2=0.796 μg·kg-1，則樣品中隱色結(jié)晶紫含量測(cè)量結(jié)果應(yīng)表示為χ=(10.148±0.796)μg·kg-1。

5 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)基于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 19857-2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定》的原理，利用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量進(jìn)行檢測(cè)。通過對(duì)測(cè)定方法中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行分析，分析測(cè)量不確定度的主要來源，建立測(cè)量不確定度評(píng)估模型，通過計(jì)算，最終得出各待測(cè)組分的擴(kuò)展測(cè)量不確定度。

結(jié)果表明：在本試驗(yàn)條件下，選擇95%置信概率，孔雀石綠含量測(cè)量結(jié)果應(yīng)表示為χ=(9.976±1.85)μg·kg-1，隱色孔雀石綠的含量測(cè)量結(jié)果應(yīng)表示為：χ=(10.186±1.550)μg·kg-1，結(jié)晶紫含量測(cè)量結(jié)果應(yīng)表示為：χ=(9.482±0.902)μg·kg-1，隱色結(jié)晶紫含量測(cè)量結(jié)果應(yīng)表示為：χ=(10.148±0.796)μg·kg-1。其中，各待測(cè)組分的測(cè)量不確定度主要來源于樣品提取液濃度測(cè)定，而加標(biāo)回收、樣品定容體積、重現(xiàn)性、稱取樣品質(zhì)量對(duì)測(cè)量不確定貢獻(xiàn)相對(duì)較小。