HPLC法測定蘋果提取物中有效成分的含量

◎ 邢新鋒，葉 強

（浙江天草生物科技股份有限公司，浙江 湖州 313300）

蘋果提取物是以蘋果汁經水或一定比例的乙醇水溶液提取分離制成的植物提取物，有效成分主要為原花青素B1、兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素和根皮苷等，具有排除鹽分、降低血壓、去膽固醇、刺激腸蠕動、利尿通便等作用，也可用作保健食品中，使保健食品香甜可口味道好。目前，天然植物成分提取行業中已了解的蘋果提取物有效成分有原花青素B1、兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、根皮苷等。雖已有不少關于蘋果提取物成分的研究，但對原花青素B1、兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、根皮苷等含量的測定卻未見文獻報道。本文建立了HPLC法測定蘋果提取物中原花青素B1、兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、根皮苷的含量的方法，為蘋果提取物的質量評價提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-15C高效液相色譜儀、DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）、PHS-3C型精密pH計（上海精密科學儀器有限公司）、HWS24電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）、MS225DU電子天平（梅特勒-托利多）、UV-1800紫外可見分光光度計（上海美普達儀器有限公司）。

1.2 試藥

樣品由浙江天草生物科技股份有限公司生產提供的樣品（批號：20180801、20180802、20180803）以及多種市售產品的樣品組成，具體樣品信息見表1。原花青素B1對照品購于成都普瑞法科技開發有限公司（批號：PRF7102743）,含量97.0%；兒茶素對照品購于中國食品藥品檢定研究院（批號：110877-201604），含量99.2%；綠原酸對照品購于中國食品藥品檢定研究院（批號：110753-201716），含量99.3%；原花青素B2對照品購于成都普瑞法科技開發有限公司（批號：PRF9042803），含量98.0%；表兒茶素對照品購于中國藥品生物制品檢定所（批號：110878-200102），含量98.0%；根皮苷對照品購于成都普瑞法科技開發有限公司（批號：PRF7101345），含量98.0%；水為娃哈哈純凈水（娃哈哈集團有限公司），乙酸（色譜級），乙腈（色譜級），甲醇（色譜級）。

表1 樣品信息表

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用十八烷基鍵合硅膠填充柱[（C18(2)，100A，4.6×250 mm，5 μm）]；以乙腈-水-乙酸（80∶20∶0.4，v/v/v）為流動相A，2%乙酸水為流動相B，按表2中的要求進行梯度洗脫；柱溫25 ℃；檢測波長為280 nm；流速為1.0 mL·min-1；進樣量20 μL。理論板數按綠原酸峰計算應不低于5 000。色譜圖見圖1。

表2 梯度洗脫表

圖1 對照品特征圖譜圖(A)

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

2.2.1.1 對照品儲備溶液的制備

精密稱取，加甲醇溶解，將原花青素B1、兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素和根皮苷分別制備成濃 度 為 0.4、0.4、2.0、0.8、0.8 mg·mL-1和 2 mg·mL-1的標準儲備液。

2.2.1.2 對照品溶液的制備

分別精密移取對照品儲備液，合并至50 mL容量瓶，用60%甲醇水稀釋至刻度搖勻待用，最后制成約含原花青素 B10.04 mg·mL-1、兒茶素 0.04 mg·mL-1、綠原酸 0.2 mg·mL-1、原花青素 B20.08 mg·mL-1、表兒茶素 0.08 mg·mL-1、根皮苷 0.2 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取供試品約25 mg于50 mL容量瓶中，加入約40 mL 60%甲醇水超聲溶解30 min，溶液冷卻至室溫后用60%甲醇水定容至刻度，搖勻待用。

2.3 線性關系考察

精密移取混合對照品溶液適量，加60%甲醇水溶解并稀釋，制成適宜的5個濃度梯度的溶液，搖勻，分別精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以對照品的濃度（c）為橫坐標，對照品峰面積（A）為縱坐標，計算線性回歸方程，并繪制標準曲線，結果見表3～8。

表3 原花青素B1線性關系測定結果表

表4 兒茶素線性關系測定結果表

表5 綠原酸線性關系測定結果表

表6 原花青素B2線性關系測定結果表

表7 表兒茶素線性關系測定結果表

表8 根皮苷線性關系測定結果表

2.4 定量限和檢測限

按照“2.1”項下色譜條件，采用對照品溶液稀釋，進樣測定。分別以3倍和10倍標準偏差對應的濃度值為測定方法的檢出限和定量限。結果見表9。

表9 檢出限和定量限表

2.5 精密度試驗

精密吸取對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件，重復進樣6次，測定峰面積，根據峰面積計算進樣精密度，結果見表10。進樣精密度試驗結果說明儀器精密度良好。

表10 精密度試驗結果表

2.6 重復性試驗

取樣品1（批號20180801）6份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件，測定6份樣品的含量，計算精密度，結果見表11。重復性試驗結果說明該方法重復性良好。

表11 重復性試驗結果表（%）

2.7 穩定性試驗

取樣品1（批號20180801）粗粉適量，在同一實驗室里，在不同的時間內，由不同的實驗者，在不同的儀器上，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，得實驗的穩定性，結果穩定，見表12。

表12 穩定性試驗結果表（%）

2.8 加樣回收率試驗

取已測定含量的蘋果提取物樣品1（批號：20180801）共18份，每份精密稱量，稱量的結果見表8，配制成相對濃度80%、100%、120%三個濃度的供試品溶液各6份，按照“2.1”項下色譜條件分析，按外標法以峰面積計算，結果見表13。

表13 回收率試驗考察結果表

續表13

續表13

結果表明，6個組分回收率都在98%～102%，符合要求。

2.9 樣品的測定

取樣品1～10適量，精密稱定，按“2.2.2”項配制成待測溶液，精密量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取各對照品適量，同法測定，按外標法以峰面積計算即得，結果見表14。

表14 含量測定結果表（%）

測定結果顯示目前蘋果提取物主要產品中原花青素B1含量都在1.8%左右，兒茶素含量都在2%左右，綠原酸含量都在10%左右，原花青素B2含量都在4%左右，表兒茶素含量都在3.5%左右，根皮苷含量都在5%左右，可以以此作為蘋果提取物的質量評價標準。

3 討論

本實驗采用HPLC法測定蘋果提取物中主要有效成分原花青素B1、兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、根皮苷的含量，方法簡便，重復性好，可用于快速測定蘋果提取物中主要有效成分的含量，為蘋果提取物的質量評價提供了新的科學參考依據。