高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速分析稻米中毒死蜱和丁硫克百威及其代謝產(chǎn)物的殘留量

楊 歡，馬有寧，秦美玲，柴爽爽，何 巧，張涵彤，牟仁祥

（中國水稻研究所農(nóng)業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，農(nóng)業(yè)部稻米產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，浙江 杭州 310006）

稻米是人類口賴以生存的主食之一[1]，水稻在中國種植面積約占世界水稻種植面積的23%，而我國水稻產(chǎn)量超過世界總產(chǎn)量的30%，排名世界第一[2]。水稻產(chǎn)量受真菌和昆蟲影響，至少有70 種昆蟲被記錄為水稻害蟲，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量[3-4]。因此，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中農(nóng)藥被廣泛用于提高作物的生產(chǎn)力和質(zhì)量，但對人體健康有害的農(nóng)藥殘留物是不可避免的[5-6]。

毒死蜱和丁硫克百威是近年來常用的低毒殺蟲劑，對水稻等經(jīng)濟(jì)作物中的咀嚼式和刺吸式口器害蟲有較好的防治效果[7-8]。毒死蜱和丁硫克百威兩種農(nóng)藥的作用機(jī)理都是通過抑制乙酰膽堿酯酶的活性來影響昆蟲正常的神經(jīng)傳導(dǎo)[9]。兩種殺蟲劑在土壤和植物中易于降解，其代謝物的毒性遠(yuǎn)高于母體。毒死蜱的主要代謝產(chǎn)物是3,5,6-三氯-2-吡啶醇（3,5,6-trichloro-2-pyridinol, 3,5,6-TCP）是一種有毒化學(xué)物質(zhì)，會導(dǎo)致男性睪丸激素水平降低[10]；丁硫克百威主要代謝產(chǎn)物為克百威、3-羥基克百威[11]，克百威與膽堿酯酶抑制的結(jié)合不可逆決定了其對人類及動物體的毒性極高[12]。同時，兩種農(nóng)藥的主要代謝產(chǎn)物水溶性好，滲透能力強(qiáng)，對環(huán)境污染比較嚴(yán)重[13]。為嚴(yán)格把控稻米質(zhì)量安全，日本規(guī)定丁硫克百威、克百威和毒死蜱在糙米中的殘留限量分別為0.2、0.1 mg/kg和0.1 mg/kg，我國規(guī)定稻谷中毒死蜱和丁硫克百威的限量為0.5 mg/kg，糙米中克百威的殘留限量為0.1 mg/kg。但國內(nèi)外對3,5,6-TCP和3-羥基克百威還未制定殘留限量，因此有必要開展毒死蜱和丁硫克百威及主要代謝物在水稻中殘留的研究。

目前，已報道的檢測方法主要有氣相色譜法[14]、液相色譜法[15-16]、氣相色譜-質(zhì)譜法[17-20]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21-23]和生物傳感器法[24]，但同時測定2種農(nóng)藥及主要代謝物的方法報道較少。本實驗采用QuEChERS前處理方法與高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)相結(jié)合，建立一種快速且回收率高、精密度好的殘留分析方法，實現(xiàn)了稻米中兩種殺蟲劑及代謝物的同時檢測，為樣品分析提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純） 德國Merck公司；甲酸、甲酸銨（均為色譜純） 美國Fluka公司；NaCl（分析純）上海試四赫維化工有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）和十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）填料（粒徑40.0 μm） 美國瓦里安公司；MgSO4（分析純） 美國Sigma-Aldrich公司；毒死蜱（純度99%）標(biāo)準(zhǔn)品 農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心；3,5,6-TCP（純度99.0%）、丁硫克百威、克百威、3-羥基克百威標(biāo)準(zhǔn)品（純度不低于95%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；實驗室用水為Milli-Q高純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Survryor系列液相色譜儀 美國ThermoFisher公司；TSQ Quantum Access MaX三重四極桿質(zhì)譜儀、Multfuge×1離心機(jī) 美國ThermoFisher公司；T25 digital ULTRATURRAX?高速勻漿機(jī)、Tube Mill control研磨機(jī) 德國IKA公司；NSART100脫殼機(jī) 佐竹機(jī)械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液和工作溶液的配制

用萬分之一天平準(zhǔn)確稱取5 種化合物的標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg（精確至0.01 mg）置10.0 mL的容量瓶內(nèi)，用甲醇溶解定容分別配制成質(zhì)量濃度為l.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。再將5 種單標(biāo)準(zhǔn)液分別稀釋成質(zhì)量濃度均為10.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于－20 ℃冰箱中保存。

1.3.2 樣品前處理方法

1.3.2.1 樣品提取

將稻米用研磨機(jī)磨成粉末（粒度1～50 μm）后稱取5.0 g（精確至0.01 g）樣品于250.0 mL離心管中，加入20.0 mL超純水浸泡30.0 min。充分浸泡后加入25.0 mL乙腈（含0.1%甲酸）置于勻漿機(jī)中勻漿2.0 min后分別加入10.0 g MgSO4、1.0 g NaCl，再經(jīng)5 000 r/min勻漿1.0 min，勻漿后將離心管置于離心機(jī)中以3 800 r/min離心3.0 min。

1.3.2.2 樣品凈化

取上層有機(jī)相5.0 mL于15.0 mL離心管中，分別加入1.2 g MgSO4、100.0 mg PSA和100.0 mg C18，用旋渦混合器充分振蕩混勻，待凈化后再放入離心機(jī)中以3 800 r/min離心3.0 min，取1.0 mL上清液過0.22 μm的有機(jī)濾膜，濾液待檢。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；柱溫：30.0 ℃；進(jìn)樣量：2.0 μL；流動相：A為含0.1%甲酸的5 mmol/L甲酸銨溶液，B為甲醇；流速：200 μL/min；梯度洗脫程序：0.0～6.0 min，30.0%～95.0% B；6.0～16.0 min，95.0% B；16.0～16.1 min，95.0%～30.0% B；16.1～22.0 min，30.0% B。

1.3.4 質(zhì)譜條件

掃描模式：正負(fù)離子模式自動切換掃描；檢測方式：動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測；電離方式：電噴霧電離（electron spray ionization，ESI）；噴霧電壓：3 300 V（ESI+），2 300 V（ESI－）；鞘氣流速：25.0 L/min；鞘氣（N2）壓力：240.1 kPa；輔助氣（N2）壓力：43.0 kPa；毛細(xì)管溫度：350.0 ℃；離子源溫度：350.0 ℃。其他質(zhì)譜參數(shù)見表l。

表1 分析物的質(zhì)譜采集離子信息Table l MS acquisition parameters for analytes

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

為使5 種分析物的色譜分離和質(zhì)譜響應(yīng)達(dá)到最佳，以甲醇-含0.1%甲酸的5 mmol/L甲酸銨溶液（50∶50，V/V）為流動相，采用“T”三通方式依次對5 種化合物的單標(biāo)溶液進(jìn)行優(yōu)化。電噴霧正離子模式下一級質(zhì)譜掃描，結(jié)果顯示質(zhì)量濃度為1 mg/L的毒死蜱、丁硫克百威、克百威和三羥基克百威標(biāo)液可形成穩(wěn)定的[M+H]+峰，在反應(yīng)離子監(jiān)測模式下優(yōu)化碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)后進(jìn)行子離子掃描，將兩對響應(yīng)值高的碎片離子確定為定性及定量離子；但3,5,6-TCP在正離子模式下靈敏度低，負(fù)離子模式掃描可得到響應(yīng)值高的[M－H]－峰。3,5,6-TCP結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，無法形成靈敏度高，穩(wěn)定性好的碎片離子，因此本實驗結(jié)果表明3,5,6-TCP在表1質(zhì)譜條件下產(chǎn)生的準(zhǔn)分子離子m/z 196與其產(chǎn)生的碎片離子相同。因此將碎片離子m/z 196確定為定性及定量離子，此結(jié)果與Gao等[23]研究結(jié)果相同，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表l。

2.2 不同提取體系優(yōu)化

因毒死蜱和克百威在堿性和中性介質(zhì)中易發(fā)生水解，在酸性溶液中較穩(wěn)定[25]，而3,5,6-TCP是極性較強(qiáng)的化合物，其pKa值為4.55，在水中溶解度高并且在水溶液中易解離[26]。在提取過程中加入適量酸所提供的H+可以通過抑制3,5,6-TCP的電離而降低其極性[16]，因此pH值是影響提取效率的最重要的因素之一。

為增加目標(biāo)化合物在有機(jī)相中的溶解度，實驗在空白基質(zhì)中添加量為50.0 μg/kg的5 種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2節(jié)的方法處理后，通過用純乙腈、含0.1%、0.5%、2.5%和5%的甲酸-乙腈體系溶劑提取，比較不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸對5 種化合物的提取效果。圖1表明，當(dāng)提取溶劑中不加甲酸時，5 種化合物的提取回收率都低于80%，在加入一定體積的酸后，各種化合物的提取回收率都不同程度的提高。其中當(dāng)甲酸的體積分?jǐn)?shù)為0.1%和0.5%時，5 種分析物提取回收率達(dá)到90%以上，而甲酸體積分?jǐn)?shù)增加至2.5%時，毒死蜱、丁硫克百威、克百威和3-羥基克百威的回收率顯著降低。為減少試劑用量，本實驗選用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸-乙腈提取體系。

圖1 甲酸體積分?jǐn)?shù)對提取回收率的影響Fig.1 Effect of formic acid concentration on analyte recovery

2.3 線性范圍與檢出限檢測結(jié)果

在已優(yōu)化的儀器條件和方法測定條件下，用流動相配制一系列不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，利用外標(biāo)法對5 種化合物定量。以各目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/L），定量離子對的峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸計算，得到的線性方程和相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明，3,5,6-TCP和其余4 種化合物分別在1.0～1 000.0 μg/L和0.2～500.0 μg/L范圍內(nèi)的質(zhì)量濃度和定量離子的峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)范圍為0.998 6～0.999 4。在空白樣品中添加5 種化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3 倍和10 倍信噪比確定化合物的方法檢出限和定量限，結(jié)果如表2所示，樣品中5種化合物的檢出限范圍為0.3～1.7 μg/kg，定量限范圍為1.0～5.0 μg/kg。

表2 5 種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table2 Linear equations, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the analytes

2.4 方法的回收率和精密度實驗結(jié)果

參考各個化合物的最高殘留限量值，在未檢出的稻米樣品中分別添加3 個水平的混合標(biāo)液，每個水平重復(fù)6 次，對方法的回收率和精密度進(jìn)行考察。按照1.3.2節(jié)方法處理后進(jìn)樣，計算加標(biāo)回收率和精密度，結(jié)果見表3。由表3可知，5 種化合物的平均回收率范圍為72.0%～99.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為0.6%～12.0%，回收率和精密度良好，可滿足稻米中農(nóng)藥及代謝物殘留量檢測技術(shù)的需要。毒死蜱、丁硫克百威、克百威和3-羥基克百威的加標(biāo)量為10 μg/kg，3,5,6-TCP添加量為25 μg/kg的條件下，空白樣品的加標(biāo)回收定量離子色譜圖見圖2。

表3 空白樣品中5 種化合物的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n= 6）Table3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the analytes spiked in blank samples (n= 6)

圖2 空白樣品添標(biāo)回收的定量離子色譜圖Fig.2 Typical SRM chromatograms obtained for spiked blank samples

2.5 實際樣品測定結(jié)果

采用建立的液相色譜-質(zhì)譜快速分析方法對各地購買的Y兩優(yōu)372、D95優(yōu)華占、中嘉早17等10 個不同品種的60 份稻米樣品進(jìn)行測定。其中，每個品種抽出1 份樣品加入添加量為10 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)溶液以測定加標(biāo)回收率考察方法的可靠性和穩(wěn)定性，剩余50 份用于測定樣品中5 種化合物的實際含量。結(jié)果顯示，10 個不同品種的水稻樣品基質(zhì)中5 種化合物的平均回收率為84.3%～97.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～6.4%，完全能夠滿足分析要求。毒死蜱和3,5,6-TCP在實際樣品中的檢出量分別為0.002～0.051 mg/kg和0.076～0.112 mg/kg，2 種化合物在樣品中的提取離子色譜圖見圖3。丁硫克百威、克百威和3-羥基克百威在50 份樣品中均未檢出。

圖3 毒死蜱（A）和3,5,6-TCP（B）在大米樣品中的提取離子色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms for chlopyrifos (A) and 3,5,6-TCP (B) in polished rice sample

3 結(jié) 論

實驗利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合QuEChERS建立檢測稻米中毒死蜱和丁硫克百威2 種農(nóng)藥及主要代謝物的檢測方法。該方法通過比較提取溶劑中不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸對提取效率的影響，優(yōu)化前處理提取過程。目前國內(nèi)外關(guān)于利用氣相色譜法[27]、液相色譜法[29]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[28]和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[30]測定2 種農(nóng)藥的方法報道較多，但其檢出限和定量限分別高于1.0 μg/kg和5.0 μg/kg，且無法實現(xiàn)同時測定稻米中毒死蜱和丁硫克百威及代謝物的殘留量。盡管本實驗所建立的技術(shù)對3,5,6-TCP分析靈敏度低于Gao等[23]分析水中代謝物的方法，但比張圓圓等[22]利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法所得的靈敏度高。實驗結(jié)果表明，各化合物在水稻基質(zhì)中的回收率可滿足基本的分析要求。本方法前處理過程簡便、高效，具有準(zhǔn)確性好、精密度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于稻米中毒死蜱和丁硫克百威兩種農(nóng)藥及主要代謝物殘留量的同時定性與定量分析。