ATR-FTIR在小麥及其制品嘔吐毒素污染水平快速測定中的應用

沈 飛，劉 瀟，裴 斐，李 彭，姜大峰，劉 琴

（1.江蘇高校現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210023；2.山東省疾病預防控制中心，山東 濟南 250014）

小麥是我國主要的糧食作物，小麥及其制品的品質優劣對于食品安全至關重要。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），又稱嘔吐毒素，是主要由小麥赤霉病菌產生的單端孢霉烯族毒素，可引起人畜中毒、代謝紊亂，有明顯的致突性、致癌性[1]。近年來，小麥赤霉病在我國大規模爆發越來越頻繁，尤其對冬麥主產區造成重大危害，其產生的DON污染已成為小麥減產和品量變差的重要原因。加強小麥DON污染的風險監測是控制其危害的前提。目前，DON檢測方法有薄層層析法[2]、高效液相色譜法[3]、氣相色譜-質譜聯用法[4]、液相色譜-質譜聯用法[5]和酶聯免疫吸附法[6]等。這些方法檢測的準確度普遍較高，但過程均較為復雜繁瑣，不能滿足現場實際檢測需求。因此，開發一種快速、準確的小麥及其制品DON污染檢測方法，對于建立健全DON污染監測體系，維護食品安全和人民身心健康十分必要。

衰減全反射-傅里葉紅外光譜（attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR）是一種分子振動光譜技術，它無需對樣品進行復雜的預處理，能夠快速獲得樣品的光譜指紋特征，已成功用于食用油[7-8]、水果[9-12]、肉類[13-15]等食品/農產品的品質與安全檢測中。在小麥及其制品研究方面，Kos等[16]利用ATR-FTIR對受DON污染的玉米進行分析，結果表明DON含量在0.13～8.23 mg/kg范圍內時，判別正確率為75%。Girolamo等[17]通過分析找到了DON所對應的特征波長，通過定性預判模型和偏最小二乘（partial least squares，PLS）法模型能夠判斷出小麥中DON含量的高低，但是該模型只適合于特定的小麥。關二旗等[18]利用近紅外光譜獲取赤霉病小麥碎粒和未感病小麥籽粒的近紅外光譜數據信息，構建了SIMCA模型，實現了小麥赤霉病粒的準確識別。但該研究中樣品量較小，結果還需要進一步驗證。綜上可知，應用光譜技術，尤其是ATRFTIR檢測小麥DON污染的研究還較為有限，對象多以小麥原糧為主，且主要集中在定性判別上。

本研究擬進一步探索不同樣品基質條件下ATR-FTIR技術的應用潛力，建立小麥、面粉以及面粉制品中DON污染的快速分析方法和模型，為實現小麥DON污染的快速、準確監測提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從農戶、糧庫和超市等處搜集小麥（34 份）、面粉（34 份）以及餅干、面包等面粉制品（30 份）樣品，共98份。將收集的樣品全部磨成粉并過20 目篩，以保持樣品檢測狀態的一致性，放于4 ℃備用。

DON標準品（純度＞99.5%） 美國Sigma公司；超純水（電阻≥18.2 MΩ）；乙腈、甲醇（均為色譜純）；其他所用試劑均為色譜純或分析純。

1.2 儀器與設備

Tensor27型FTIR儀 德國Bruker公司；ZnSe ATR附件 美國Pike公司。

1.3 方法

1.3.1 ATR-FTIR測量

將冷藏樣品置于室溫（23±1）℃平衡2 h，運用FTIR儀和ZnSe ATR附件（采集樣品的光譜信息。用天平稱取1 g粉末樣品放于ATR 附件的ZnSe晶體上，以空氣背景進行檢測，掃描波數范圍4 000～600 cm－1，分辨率4 cm－1，掃描64 次，樣品重復掃描3次，取平均值作為樣品的光譜數據[19]。

1.3.2 DON含量測定

樣品中DON含量的測定綜合參考羅穎鵬[3]、王麗娟[20]等的方法，將所有樣品清雜后用粉碎機全部粉碎成粉（過20 目篩），準確稱取25.0 g樣品到250 mL錐形瓶中，加入100 mL乙腈-水（84∶16，V/V）溶液，渦旋混勻1 min，振蕩提取30 min，在 10 000 r/min離心10 min，取上清液過MycoSep226凈化柱凈化。棄掉最先流出的2 mL凈化液，取5 mL凈化液40 ℃氮氣流吹干，殘余物用1 mL含0.2%氨水的乙腈-水（10∶90，V/V）復溶，渦旋30 s。再用0.22 μm有機濾膜過濾，2 mL進樣瓶收集濾液，高效液相色譜-質譜測定。該方法的檢出限為1 μg/kg，樣品的加標回收率為89.8%～107.96%。

1.4 數據分析

數據處理軟件采用TQ Analyst v 8.6.12（Thermo Electron 公司，美國）軟件。運用偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）分析和逐步多元性回歸（stepwise multiple linear regression，SMLR）分析方法建立DON毒素定量預測模型，自變量為樣品的中紅外光譜信息，因變量為樣品中DON毒素含量，隨機地選取樣品的2/3作為建模集，1/3作為驗證集。為消除來自高頻隨機噪聲、基線漂移、樣本不均勻等對建模帶來的影響，采用多元散射校正（multiplicative signal correction，MSC）以獲得較好的預測效果，在建模過程中采用留一交互驗證的方法保證模型的穩健性[21]。用模型決定系數（correlation coefficient of determination，R2）、建模均方根誤差（root mean squared error of calibration，RMSEC）、預測均方根誤差（root mean squared error of prediction，RMSEP）、交互驗證均方根誤差（root mean squared error of cross validation，RMSECV）和相對分析偏差（residual predictive deviation，RPD）[22]以及模型檢測限[23]等指標對模型性能進行評價。

2 結果與分析

2.1 ATR-FTIR分析

圖1 不同DON含量樣品的中FTIR圖Fig.1 FTIR spectra of samples with different DON contents

小麥赤霉病主要是由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、黃色鐮刀菌（F. culmorum）和串珠鐮刀菌（F. moniliforme）等鐮刀菌感染引起的[24]，而鐮刀菌所產毒素主要為DON。研究表明[25]由于鐮刀菌的呼吸作用會分解大分子物質，當小麥中DON含量增加時，淀粉、蛋白質和脂肪會發生不同程度的變化，同時鐮刀菌產生的DON會進入淀粉和蛋白質中從而導致淀粉和蛋白質之間的結合變疏松，進而導致粗淀粉和粗蛋白的含量降低；鐮刀菌的生長需要消耗能量，同時導致脂肪的氧化，故粗脂肪的含量逐漸下降，脂肪酸值在逐漸上升[26]。

檢測結果顯示，9 8 份樣品中D O N的含量在0.02～4.53 mg/kg之間，平均值為1.93 mg/kg。圖1a為不同DON含量小麥的ATR-FTIR的光譜圖，整體來看，樣品在4 000～600 cm－1范圍內的中紅外譜圖比較相似，存在較多的共同譜峰。DON含量低的樣品的吸收值總體上略高于DON含量高的樣品。由圖1b可知，在1 740 cm－1處DON含量低的樣品的吸收值明顯高于DON含量高的樣品，鐮刀菌在產DON毒素的過程中能夠促進脂肪的氧化，從而使得脂肪酸值上升；在1 648 cm－1（酰胺I）和1 549 cm－1（酰胺II）處有較明顯的吸收峰且DON含量高的樣品吸收值要高于含量低的，這主要是由于黃色鐮刀菌產生的蛋白酶能夠水解小麥中的蛋白質生成氨基酸[27-28]。在1 300～900 cm－1波數處主要是由淀粉吸收鍵的振動引起的，鐮刀菌在產DON毒素的過程中需要消耗能量，主要是通過水解淀粉等糖類物質為其生長代謝提供能量[29]。分析發現，樣品在1 900～900 cm－1波段范圍內光譜差異較為顯著，因此用于后續分析。

2.2 PLSR建模分析

在PLSR分析過程中，為了進一步對獲取光譜進行分析，對所有樣品的前3 個PLS因子的潛變量（latent variable，LV）進行權重分析，結果如圖2所示。LV1的最高權重位于1 745、1 657、1 475 cm－1和1 180 cm－1處，主要由脂質、脂肪酸和蛋白質引起的。鐮刀菌產DON過程中，樣品中的脂肪氧化產生脂肪酸，由于脂肪酸中C=O的對稱伸縮振動導致光譜在1 745 cm－1出現較強的峰；其中氨基酸中的COO的伸縮振動會在1 600～1 555 cm－1附近出現較強的吸收帶，蛋白質分子中的—CO—NH—基團的C—N伸縮振動和C—N—H的面內彎曲振動之間產生耦合，分別在1 640 cm－1和1 540 cm－1附近出現特征峰。LV2最高權重位于984 cm－1處，主要是由糖類引起的；LV3的最高權重位于1 545、1 385、1 088、1 046 cm－1和989 cm－1處，主要是由脂質、蛋白質及糖類引起的。由于糖類中含有多個的C—OH，而C—OH伸縮振動會使光譜在1 100～1 000 cm－1附近出現多個吸收峰[30-31]。

圖2 用于DON分析的PLSR模型前3 個因子的權重光譜Fig.2 Loading spectra of the first three factors for DON analysis by PLSR model

利用PLSR對小麥及其制品中DON含量進行預測分析，從而判斷小麥及其制品的食用安全狀況。利用ATRFTIR對DON毒素含量進行建模時，采用4 種不同的預處理方法對采集的原始光譜進行處理，結果如表1所示，僅用MSC預處理光譜時，可獲得較高的RC2和較低的RMSEC，且RMSECV與RMSEP值均較小。此外，RPD值在2～2.5之間說明模型具有定量預測的潛能，在2.5～3之間說明模型用于定量分析，大于3時，表示模型預測精度高、可用于實際定量分析[32]。如表1所示，MSC預處理PLSR模型的RPD值達到2.6，定量分析的檢測限為1.435 mg/kg，表明模型在快速篩分及定量檢測方面具有一定的實際應用潛力。

表1 小麥及其制品中DON含量的PLSR定量分析結果Table1 PLSR prediction of DON contamination in wheat and its products

2.3 SMLR建模分析

表2 小麥及其制品中DON含量的SMLR定量分析結果Table2 SMLR prediction of DON contamination in wheat and its products

SMLR可以對自變量進行篩選，剔除不具備顯著性意義的變量，從而確定一個最佳的線性回歸方程。利用SMLR進行預測分析時分別選擇7、9、11 個和13 個波段數進行分析，分析前運用MSC對光譜進行預處理，結果如表2所示。結果表明，建模時所選取波段中有些與DON產生有關，有些與DON的產生存在間接的聯系。在所選的13 個波段中，1 537、1 562、1 600、1 680 cm－1和1 677 cm－1均是蛋白質的特征吸收峰；1 525、1 507 cm－1和1 479 cm－1為脂肪的特征吸收峰；1 073、1 083 cm－1和1 027 cm－1處為淀粉的特征吸收峰；1 785 cm－1為脂肪酸特征吸收峰；而1 824 cm－1吸收值很小，可能為噪聲等雜峰。而DON的產生主要與淀粉、蛋白質和脂肪相關，所以通過波段的選擇可以提高預測結果的準確性。建模結果顯示，所選波段數為9 個和13 個時，建模效果較其他兩組要好。評價預測模型的優劣主要是通過、RMSEP值評價，通過對比發現在選取9 個和13 個波段進行預測時效果較好。通過斜率和截距的大小也能反映出線性模型效果的優劣，斜率越接近1，截距越接近0表明線性相關性越好。對比9 個波段和13 個波段的結果發現，選取9 個波段進行分析時相關性較好，斜率和截距分別為0.940 2和0.166 6，此時模型的RPD值為2.6，檢測限為1.50 mg/kg。

圖3 小麥及其制品DON毒素含量的PLSR（a）和SMLR（b）模型預測結果圖Fig.3 Predictive models for wheat and its products by PLSR (a) and SMLR (b)

利用PLSR和SMLR對小麥、面粉以及小麥制品建立分析預測模型。全部樣品的PLSR模型預測結果見圖3a，所有樣品都分布于中心線兩側，共8 個因子用于計算，預測集的值為0.86，RMSECV與RPD值分別為0.507 mg/kg、2.6。圖3b為選取9 個波段時的SMLR模型，預測集的值為0.86，RMSECV與RPD值分別為0.495 mg/kg、2.6，預測結果顯示通過PLSR和SMLR建模可預測小麥、面粉及其他小麥制品中的DON含量。

PLSR是對全光譜進行建模分析的，數據矩陣分解和回歸交互結合，得到的特征向量直接與樣品性質相關，故所建模型一般較為穩健。但由于選取的光譜范圍內存在干擾峰并且存在低含量的樣品預測誤差大的缺點，所以實際應用時利用PLSR模型對DON低于其檢測限的樣品進行分析時的效果可能不佳。SMLR是隨機選取多個譜帶進行分析，在分析的過程中將干擾峰和噪音峰剔除，但由于選擇譜帶的隨機性，有些譜帶與DON的產生存在直接的關系，有些則無關，所以可能導致模型預測性能下降。

3 結 論

本研究表明ATR-FTIR技術可作為一種快速分析方法，評估小麥及其制品的DON污染情況。研究表明，不同DON含量樣品在1 740、1 648、1 549 cm－1等附近的吸收值存在顯著差異，可作為DON定量檢測的指紋圖譜加以利用。PLSR和SMLR的模型結果預測誤差較低，RMSEP分別為0.438 mg/kg和0.426 mg/kg，RPD值均為2.6，具有一定的實際應用潛力。然而，本研究所用樣品數量仍較為有限，進一步研究需要補充更多的代表性樣品，以不斷增強模型的穩健性和適用性。