基于多重修飾酶電極技術檢測大豆油中磷脂含量

王立琦，劉雨琪，陳穎淑，王 雯，王睿智，劉亞楠，張 欣，隋玉林,，于殿宇,

（1.哈爾濱商業大學計算機與信息工程學院，黑龍江 哈爾濱 150028；2.黑龍江省電子商務與信息處理重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150028；3.哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076；4.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

脫膠是大豆油精煉過程中的重要環節，目的是將大豆毛油中的磷脂等膠質脫掉，是后續脫色和脫臭的基礎，因此在油脂加工過程中需要不斷檢測大豆油中磷脂含量。傳統的檢測方法是進行化學分析，檢測速度慢、成本高、受人為因素和實驗環境影響大、易污染環境，更不利于在線檢測和調控[1-3]。大豆毛油中磷脂的含量高，其中卵磷脂占主要組成部分。

磷脂的傳統檢測方法包括紅外吸收光譜法、紫外分光光度法、高效液相色譜法[4]、薄層色譜法、核磁共振氫譜法[5]、色譜-質譜聯用法[6]等。但這些檢測方法存在成本高、操作復雜、分析速度慢、難以快速實時檢測等特點。因此檢測大豆毛油中的磷脂先從單一的卵磷脂入手，并逐步應用到含有多組分的大豆毛油中。

而電化學分析技術具有快速、準確、易于實現在線檢測等優點[7-8]，近年來在食品安全領域得到廣泛應用。絲網印刷電極是一種一次性電極，具有制作簡單、成本低廉、靈敏度高、響應速度快、便于攜帶等特點[9]。方便對市場上各種分析物進行可重復的和一次性的現場檢測[10]。絲網印刷電極生物傳感器能夠彌補傳統氣相色譜-質譜方法檢測費用高、速度慢等不足，常用于農產品中的農藥殘留檢測[11-13]，在食品的快速檢測中也具有諸多優點，因而廣泛用于食品衛生安全性的檢測[14]。Li Shuguo等[15]制備了聚吡咯修飾電極的電化學傳感器，利用線性電位伏安法檢測植物油中酸價的含量，與傳統滴定法相比，該檢測方法靈敏度、準確度高，需要少量的植物油樣品，無需預處理。Hsu等[16]制備了固定酶修飾印刷絲網電極的電化學傳感器，實現對甘油二脂的測定，檢測靈敏度高；Robledo等[17]采用電化學方法結合人工神經網絡測定食用植物油中生育酚同系物的含量，結果顯示，食用油中生育酚含量實測值和生產商標注VE含量基本一致；王麗然等[18]采用殼聚糖為固定化材料，制備了有機相辣根過氧化物酶傳感器，經循環伏安法實現了對植物油中過氧化值含量的測定，檢測結果優于國標碘量法，并且檢測時間短、準確度較高；郭敬軒等[19]利用多孔碳修飾玻碳電極并通過循環伏安法檢測油脂中抗氧化劑丁基羥基茴香醚的含量；劉曉偉等[20]基于電化學方法，建立了電流型酶傳感器，實現了對花生油中黃曲霉素B1的快速檢測。

目前，國內外鮮有關于磷脂電化學方法檢測的報道，本研究參考磷脂的性質和油脂中其他物質的檢測方法，采用絲網印刷電極，以四氧化三鐵-殼聚糖納米復合物，然后用交聯劑將辣根過氧化物酶和膽堿氧化酶依次交聯到修飾絲網印刷電極表面，制備多重修飾酶電極。構建一種酶電極，通過電化學方法間接或直接檢測分析磷脂的含量，具有廣泛的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

一級大豆油 九三糧油工業集團有限公司；磷脂酶D（168 U/mg）、膽堿氧化酶（18 U/mg）、辣根過氧化物酶（265 U/mg）、磷脂酰膽堿（99%） 美國Sigma公司；納米四氧化三鐵 汕頭市西隴化工廠有限公司。

1.2 儀器與設備

CHI660D電化學工作站 上海辰華儀器公司；EI3002絲網印刷電極 南京中科電極有限公司；MATLAB R2015a（Math Works）、Unscrambler X10.3挪威CAMO公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

以一級大豆油為基料，通過添加一定量的大豆粉末磷脂、磷脂酶D（10 U/mL）及1%的Triton-X100作為乳化劑，制備出40 個磷脂含量不同的混合大豆油樣品，并采用國標法（鉬藍比色法）測量樣品中磷脂含量標準值。

1.3.2 多重修飾酶電極的制備

由于磷脂酶D酶解磷脂生成磷脂酸和膽堿過程中不產生電子轉移，針對此問題本實驗研制多重修飾酶電極傳感器，制備四氧化三鐵-殼聚糖納米復合物，利用乙酸添加四氧化三鐵納米粉，超聲處理分散60 min，最后獲得一種均一穩定的黑色懸浮液。所獲得的高度分散黑色懸浮液為四氧化三鐵-殼聚糖納米復合物，將其均勻涂于經預處理的絲網印刷電極表面，獲得四氧化三鐵-殼聚糖修飾電極，然后將2.5 μL酶活力為0.8 U/μL的辣根過氧化物酶溶液和2.5 μL 1.2 U/μL的膽堿氧化酶溶液分別通過戊二醛交聯固定在修飾電極上，制得多重修飾酶電極傳感器，組裝過程見圖1。

圖1 多重修飾酶電極的組裝過程Fig.1 Assembling of multiple modified enzyme electrodes

1.3.3 電化學數據采集

多重修飾酶電極使磷脂酶解副產物膽堿繼續氧化產生過氧化氫，再對酶解副產物過氧化氫進一步酶解，使本不產生電子轉移的酶解過程，通過對其酶解副產物逐步酶解，間接產生電子轉移并轉化成電信號，然后將多重修飾酶電極與電化學工作站連接，采用循環伏安法掃描，電位掃描范圍為－0.6～0.8 V，掃描速率為0.01 V/s[21]。

1.4 數據處理

首先，對采集的原始電化學數據分別利用Savitzky-Golay平滑濾波和dbN系列小波進行去噪處理，然后再分別利用還原峰電流與磷脂含量直線擬合、主成分回歸、偏最小二乘回歸和支持向量機回歸4 種方法建立校正回歸模型。

2 結果與分析

2.1 磷脂循環伏安曲線

圖2 磷脂的循環伏安曲線Fig.2 Cyclic voltammograms of phospholipids at different concentrations

如圖2所示，磷脂質量濃度為5.87～304.89 mg/L，隨著磷脂質量濃度的增加，大豆油樣品的循環伏安曲線的還原峰電流越小，在磷脂質量濃度為5.87～304.89 mg/L范圍內，還原峰電流大小與磷脂的質量濃度呈現良好的線性關系。

2.2 電化學數據預處理

由于人工操作失誤、儀器異常、環境（如溫度、濕度等因素的變化）或者樣品本身等原因[22]，測定樣品時經常會出現個別異常樣本，這些異常樣本不能用于模型的建立，需將其剔除。本實驗基于原始電化學數據建立了偏最小二乘校正模型，根據預測值與實際值的偏差剔除異常樣本2 個，為提高模型預測精度，再分別利用Savitzky-Golay平滑濾波和dbN系列小波對原始電化學數據進行去噪處理。

2.2.1 平滑去噪

Savitzky-Golay法最突出的優點是它能夠有效地保留數據的原始特征，其本質就是利用窗口內部各個點之間的加權來計算平滑后的新值，關鍵在于如何選擇多項式次數和窗口點數，選擇不同的組合，結果也會不同[23]。本實驗選取窗函數大小為5～15 點之間的奇數，多項式次數為2、3、4、5進行驗證，并通過平滑降噪后的均方誤差、信噪比、數據能量占原始能量的比例和平滑度來評價去噪的效果。窗函數較大可以提高信噪比，但難免會導致信號失真，經分析對比平滑去噪效果可知，窗函數大小為13 點、多項式次數為2時，平滑處理去噪效果最好，其均方誤差為0.041 685，信噪比為28.26，數據能量占原始能量的比例為0.989 4，平滑度為0.409 61。為獲得電化學數據降噪處理的最佳效果，本實驗再采用小波去噪法對電化學數據進行降噪處理。

2.2.2 小波去噪

采用Daubechies小波對電化學數據進行多尺度小波分解以達到消除噪聲的目的。Daubechies小波一般簡寫成dbN，N是小波的階數，Daubechies小波基是一個小波族[24]，db1～db10有10 個小波基，如何選擇最適合的小波基，目前的研究報道中鮮見有較好的方法，只能通過反復實驗進行篩選。本實驗中樣本長度為282，db9、db10最大分解尺度3，為方便分析比較，將其他小波基的分解尺度也設定為3，閾值方式選擇基于Stein無偏似然估計的軟閾值估計，以不同小波基對電化學數據進行去噪，并獲得了不同小波基函數去噪后的均方誤差、信噪比、去噪信號在原信號中的能量比例和平滑度，經分析比較可知，db6小波基函數時，平滑度最小為0.086 19，去噪效果最好，并且其均方誤差較小為0.011 37，信噪比較大為30.21，去噪信號在原信號中的能量比例為0.999 8。

信號的小波分解需根據信號長度確定最大分解層數，本實驗中校正集樣本長度為282，最大分解尺度為4，表明本實驗的電化學數據在去噪中的分解尺度可為2、3或4。對于多少尺度分解能達到最佳效果，還要通過實驗的方法確定，將db6小波基在不同分解尺度和4 種閾值方式下分別對電化學數據進行降噪處理，經綜合比較分析去噪結果發現db6經3尺度分解去噪效果較好，且4 種閾值方式中基于Stein無偏似然估計的軟閾值估計方式去噪的均方誤差為0.010 77，信噪比為30.21，去噪信號在原信號中的能量比例為0.999 8，平滑度為0.086 19，去噪效果最佳。

綜合以上研究結果，將基于Stein無偏似然估計的軟閾值估計方式的db6小波基對大豆油脂的電化學伏安曲線數據進行三層小波分解去噪處理與Savitzky-Golay平滑處理最佳效果進行分析對比，經小波去噪和平滑處理后的伏安曲線降噪效果對比見表1。經表1對比分析，整體來看小波去噪效果明顯優于Savitzky-Golay平滑處理，因此本實驗采用小波去噪方法對原始電化學數據進行處理。

表1 經小波去噪和平滑處理后的伏安曲線降噪效果對比Table1 Comparison of noise reduction of voltammograms by Savitzky-Golay smoothing filter and db6 wavelet three-layer decomposition

2.3 校正模型的建立

為構建可靠、穩定的分析校正模型，分別采用4 種方法建立去噪后的電化學數據與磷脂質量濃度之間的回歸模型，首先利用還原峰電流與磷脂含量之間進行直線擬合，再采用主成分回歸[25]、偏最小二乘回歸[26]和支持向量機回歸[27]建立校正回歸模型，并采用決定系數R2、預測均方根誤差和相對標準偏差3 種評價指標來衡量模型預測效果，通過分析對比4 種方法的建模效果，以期尋找出最佳磷脂含量檢測模型。

2.3.1 峰電流與磷脂質量濃度的線性擬合

多重修飾酶電極在不同質量濃度的磷脂溶液中經掃描得到其電流-電位循環伏安曲線，為明確循環伏安曲線的峰電流與磷脂質量濃度的關系，首先提取曲線的峰值，借助還原峰電流與磷脂質量濃度化學值之間進行簡單的單變量線性擬合。

圖3 還原峰電流與磷脂質量濃度關系圖Fig.3 Relationship between reduction peak current and phospholipid concentration

將提取還原峰電流與磷脂質量濃度化學值進行簡單的線性擬合，如圖3所示。隨著磷脂質量濃度的增加，還原峰電流不斷減小，其線性回歸方程為ipc＝－1.02lgC+4.341，磷脂質量濃度在5.87～304.89 mg/L范圍內呈現良好的線性關系，檢出限為1.68 mg/L（RSN=3）。其決定系數R2為0.987 6，預測均方根誤差為0.557 1，相對標準偏差為4.93%。

2.3.2 回歸校正模型

由于循環伏安曲線的峰電流易受儀器或其他環境因素的影響而產生波動，實際和提取的峰電流可能存在一定的偏差[28]，所以簡單的單變量線性擬合模型對磷脂質量濃度的預測并不一定能夠滿足實際檢測要求。為建立更高精度的預測模型，再利用主成分回歸、偏最小二乘回歸及支持向量機回歸在電化學數據與磷脂質量濃度標準值之間建立回歸校正模型，以期尋找最佳的磷脂檢測模型。

首先對數據進行樣本分集，將38 個樣品按磷脂含量的多少進行排序，按照一定梯度變化從中選取28 組作為訓練集樣本，用于建立模型，剩下的10 組數據作為預測集樣本，用于驗證模型的適用性，訓練集樣品和預測樣品集的磷脂含量平均值應盡量接近，并且訓練集包含樣品中的最大值和最小值，樣本校正集和預測集統計結果見表2。

表2 樣本校正集和預測集統計結果Table2 Statistical analysis of calibration and prediction sets

利用美國MathWorks公司的Matlab R2015a數據分析軟件中的主成分回歸算法[29]、偏最小二乘回歸算法及Unscrambler軟件中的支持向量機回歸算法[30]并采用4 種核函數即線性核函數、多項式核函數、徑向基核函數和神經元的非線性作用函數核函數對大豆油中磷脂含量的化學值和電化學數據建立回歸校正模型，然后將預測結果與實際值進行對比，分析計算其誤差。經研究，基于神經元的非線性作用函數核函數的支持向量機回歸建模效果很差，所以之后將不再進行討論，建模效果評價指標對比見表3。

表3 建模效果評價指標對比Table3 Comparison of prediction performances of regression models

由表3可以看出，主成分回歸模型建立效果比直線擬合差，偏最小二乘回歸及支持向量機回歸模型建立效果均優于直線擬合模型。經分析比較可知，基于徑向基核函數支持向量機回歸方法建立回歸校正模型對未知樣品的預測效果最佳，支持向量機回歸（徑向基核函數）的回歸預測模型如圖4所示。

圖4 支持向量機回歸（徑向基核函數）回歸預測模型Fig.4 SVMR prediction model (based on radial basis function)

基于徑向基核函數的支持向量機回歸對電化學數據與磷脂含量標準值建立的回歸校正模型對未知樣品預測效果最佳，樣本均分布在擬合線附近，其模型的決定系數R2為0.998 7，預測均方根誤差為0.288 9，相對標準偏差為2.55%，可以滿足實際檢測要求。

3 結 論

利用多重修飾的酶電極采集不同磷脂含量的大豆油樣本的電化學循環伏安曲線，通過去噪處理使循環伏安曲線的還原峰電流與大豆油中的磷脂含量進行直線擬合。再分別利用主成分回歸、偏最小二乘回歸和支持向量機回歸4 種方法根據其對應的標準化學值建立回歸預測模型，研究發現基于徑向基核函數的支持向量機回歸模型預測效果最佳，統計指標均達到預期效果，滿足實際檢測要求。本研究可為實現油脂中磷脂實時有效的在線檢測提供理論依據。