全基因測序（WGS）在腸桿菌科細菌中的應用研究

周子超，何嵐，丁月平

（1.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310005；2.浙江中醫藥大學附屬第二醫院ICU，浙江 杭州 310005）

0 引言

全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）是通過新一代的生物信息技術，并結合新的模式識別方法和網絡分析，來分析不同機體基因組間的結構差異手段來分析不同機體基因組間的結構差異、單核苷酸的多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）和核心基因組多位點序列（core genome multilocus sequence typing，cgMLS）。具有信息全面、精確、高通量及高分辨率等優點。且隨著高通量測序技術的發展，測序成本的大幅降低，WGS檢測技術得以迅速普及，并快速超越傳統策略，成為當前群體進化、變異分析和功能基因挖掘的最主要研究策略，在細菌流行病學中得到了廣泛的應用。

腸桿菌科細菌是臨床上常見的條件致病菌，可致肺炎、泌尿道感染、腹膜炎，菌血癥等疾病。隨著碳青霉烯類等抗菌藥物的廣泛和不合理應用，細菌耐藥性普遍增加，甚至出現了碳青霉烯類耐藥，顯著增加了臨床治療的難度，耐藥菌的流行。因此，全面監測該類細菌的致病性、耐藥機制和臨床流行病學具有重要的意義。

本文將WGS在腸桿菌科細菌中的應用作一綜述，以期為WGS在細菌流行病學中的應用提供理論參考。

1 全基因測序技術概況

全基因組測序技術現階段應用主要包括第二代測序技術（NPS）和第三代測序技術。在第一代測序技術（Sanger法）成本和速度發展至極限卻依然無法大規模應用的情況下，第二代測序法應運而生。2005年，454 Life sciences公司（現被Roche公司收購）首次基于焦磷酸測序法，以“邊合成邊測序”為核心，“片段-磁珠-讀長”的形式，達成了“超高通量”——能同時測序幾十萬到幾百萬條DNA分子，由此開辟了第二代測序技術的先河。隨著科技的不斷創新，2011年，第三代測序技術以單分子熒光、納米孔及實時記錄為技術核心，在原有的化學的間接性檢測基礎上融入顯微鏡觀察的直接性實時物理檢測，測序效率提升了2萬倍；在直接檢測與讀長增長的雙重條件下，結合更為先進的設備與熒光技術，使得精確率高達99.9999%。

綜上可知，每一代測序技術所基于的檢測（標記）技術各不相同，即每一代誕生均為質的改變。三代測序技術在研究應用中不斷發展，尤其是第三代測序技術，突破技術制約，使其在研究領域迅速普及，成為當前細菌群體進化、變異分析和功能基因挖掘的最主要研究策略，并在細菌流行病學中得到了廣泛的應用。

2 WGS在腸桿菌科細菌中的應用

2.1 致病性研究及診斷應用

WGS具備高通量及高分辨率的特點，可更加精確、快速地應用于體液檢測。因而WGS有望應用于消化系統、呼吸系統、生殖泌尿系統等疾病的臨床致病機制及藥物靶點研究，從而為其診斷及后續治療提供新思路。

大腸埃希菌、志賀菌、沙門菌均是常見的腸桿菌科類消化系統致病菌。基于WGS的應用，研究發現大腸埃希菌O157：H7的基因組變異主要歸因于某些噬菌體的動態性，使細菌菌株具有可變的毒力基因譜[1]；揭示了志賀菌的毒力因子具有協同致病機制[2]。

呼吸系統病原菌是醫院內感染暴發的首要源頭，其中耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌（KPC-KP）更是臨床治療攻克的難關。全基因組測序讓KPC-KP的診斷和治療有了新的進展：現已發現并確認了幾株毒力基因高頻率出現的分離株的基因序列[3]；浙江大學第一附屬醫院余威團隊應用WGS模擬技術證明了磷霉素聯合治療對大腸埃希菌的體外抗菌作用[4]。

美國、英國、中國等各大醫院發現臨床WGS可快速揭示與臨床癥狀對應的相關基因序列，極大地降低了診斷的假陰性率[5]。根據致病菌的基因序列的測定，提出診斷依據，并做出療效評估，從而降低了醫院內感染的發生率。

與傳統的實驗室檢測手段相比，WGS可直接應用于血流中殘存病原體DNA的檢測，直接從液體血培養中收集抗性基因[6]，提供單種抗生素的敏感性測定及預測，避免了高抑制劑和人類細胞或DNA濃度對檢測設備及技術的限制；比較分離培養物和尿液標本的WGS結果，直接從尿液中測序可以在多微生物樣品中進行細菌鑒定，可以在一些培養陰性的樣品中觀察到了其他可能的致病菌株。

由于同一基因序列的可存在于多種菌株的全基因組序列中，利用WGS技術可以橫向研究含同一基因的致病菌的發病機制，能夠為臨床標本提供相關信息，大大縮短診斷時間，相對延長治療的黃金時間窗。WGS從基因遺傳性層面出發探究病原體的致病機理，為疾病病因的診斷，新菌種致病性提供了新的理論依據，在一定程度上降低了傳統檢測手段從形態、成分檢測上人為主觀因素影響造成的假陽性率和假陰性率，客觀地描述了致病菌的存在形式及所屬類別，同步提高了準確度和可靠性。

此外，為了克服數據分析的障礙，已有研究開發了一種公開提供的生物信息工具[7]，這表明WGS已具備走出實驗室，應用于臨床的條件。

2.2 耐藥機制研究

隨著抗生素的廣泛和不恰當應用及對醫院內感染的逐步重視。使用全基因組測序儀對耐藥菌和標準菌中耐藥機制通路相關基因全序列及保守序列進行基因測序，計算機分析、識別已知基因與臨床耐藥相關的突變。由此，WGS可具象化挖掘出更罕見、多樣化的耐藥基因，提供多重耐藥菌基因型，并能夠準確預測抗性表型，成為檢測細菌耐藥突變的寶貴工具。

在近幾年間，針對各耐藥菌的測序已在發達國家快速開展：美國報告了第一個完全組裝的產志賀毒素的志賀菌多藥耐藥全基因組序列[8]；湯姆·德曼報告了一種對所有26種抗生素都不敏感的肺炎克雷伯菌的基因組特征[9]；西班牙的一種罕見的碳青霉烯酶類型（IMP-8）被WGS鑒定為陰溝腸桿菌分離株[10]。由此可見，以基因突變為基礎的耐藥菌產生機制，已經可以從“基因層面”這一源頭找到監測措施，證明了監測程序作為檢測編碼抗菌素耐藥性的意外基因的有效工具的實用性。

面對多重耐藥基因，傳統分子研究技術需要分多次研究、拆分多個層次，從而不可避免的產生了針對性治療的局限性。WGS根據“化整為零”再“化零為整”的作用原理，可通過大規模并聯測序儀，同步對菌株實行全基因組序列多耐藥檢測，為后續的整體化治療奠定基礎。

2.3 流行病學研究

基于WGS的單核苷酸多態性分型和核心基因組多位點序列分型，通過全球同類致病菌基因的橫向比對，加速了致病菌來源的測定速度，可達到及時阻斷傳染源的傳播途徑，加速疫情控制的目的。

有文獻顯示，近年英國多個地區應用WGS技術，迅速發現并切斷地中海、以色列等地的飲食來源致病菌的傳播途徑，有效地控制了腸道性疾病疫情的大規模暴發[11-12]；通過對亞洲內外六個國家分離的60株耐環丙沙星的沙門菌進行基因組測序，發現在南亞地區識別的以導致個體患病的致病菌很可能正在推動目前環丙沙星耐藥沙門菌的在洲際的激增[13]。在無性系和碳青霉烯酶基因的多樣性上證明，產碳青霉屬腸桿菌科在挪威地區的傳播依然有限，其感染主要與出國旅行有關[14]。

與傳統分子追蹤技術相比，使用WGS進行的回顧性被動監測在告知治療、識別區域流行病亞譜系方面具有實用價值，并為解釋前瞻性的、地方性的疾病提供一個框架。現階段，美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）等共享數據庫中存在大約5200株肺炎克雷伯菌全基因組序列，這將有助于跟蹤這些致命性病原體的全球傳播[15]，表明將WGS應用于分子流行病學研究，可以更好地了解多藥耐藥菌株在世界范圍內的傳播情況，并可作為發現和確定現有和新現致病菌的一個強有力的監測工具。

3 結語

綜上所述，全基因組測序能對菌株的多重耐藥基因譜、毒力基因譜進行同步分析，可直接在體液中鑒定致病菌的血清型，并對其進行分子分型診斷研究。同時隨著該技術在腸桿菌科細菌檢測上的日漸成熟，已有公開的信息分析平臺用于全基因組序列分析檢測對照，成為了腸桿菌科全球防控的有力監測工具。而在其他致病菌中推廣時也發現，WGS現階段依舊存在基因譜構建不全，適用范圍受限；技術成本高，生物信息分析標準化尚未實現；未知突變序列無法解釋等不足。希望未來通過努力能將這一快速檢測分型方法盡快應用于臨床診斷及疾病防控，提高患者疾病的治愈率，提升國民生活質量。