不同產(chǎn)地厚樸藥材中3種木脂素類成分含量測定及聚類分析＊

荊文光，張 權(quán)，杜 杰，王繼永，孫曉波，蘭青山＊＊

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所 北京 100193；2.中國中藥公司中藥研究院 北京 102600）

厚樸（Cortex Magnoliae Officinalis），始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，其后歷代本草均有記載，為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.或凹葉厚樸M.offcinalisRehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮[1]。厚樸性溫，味苦、辛，具有燥濕消痰、下氣除滿的功效，用于濕滯傷中、脘痞吐瀉、食積氣滯、腹脹便秘、痰飲喘滿，臨床上用于治療慢性腹瀉、便秘、腸梗阻、急慢性胃炎、胃輕癱、胃十二指腸潰瘍等疾病[2]。厚樸主產(chǎn)于四川、湖北、安徽、浙江、湖南、江西等地，其中道地產(chǎn)區(qū)分布以湖北恩施為中心，其盛產(chǎn)的“紫油厚樸”質(zhì)量較佳；而產(chǎn)于湖南等地的凹葉厚樸占全國厚樸總產(chǎn)量的60%[3]。根據(jù)文獻(xiàn)記載，厚樸含有木脂素、苯乙醇苷、酚苷、生物堿、揮發(fā)油等多種活性成分[4]，其中厚樸酚與和厚樸酚作為厚樸中的代表性成分，現(xiàn)代藥理研究表明具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[5]；2015版《中華人民共和國藥典》現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以此兩種成分作為含量測定指標(biāo)。

文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC和GC法測定藥材、中成藥中厚樸酚及和厚樸酚含量較多，此外潘偉[6]等利用超高效液相色譜法測定消積化蟲散中厚樸酚與和厚樸酚含量；夏麗珍[7]采用一測多評法測定藿香正氣水中厚樸酚與和厚樸酚的含量。對于厚樸藥材質(zhì)量控制，薛珍珍[8]等建立了厚樸酚類和水溶性成分HPLC含量測定方法；董佳悅[9]等分析建立了四川不同產(chǎn)地厚樸中揮發(fā)油和多糖的含量測定方法，為川厚樸產(chǎn)區(qū)優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源篩選及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考；楊紅兵[10,11]對湖北恩施產(chǎn)厚樸的生物堿和揮發(fā)油進(jìn)行了定量分析；張怡辰[12]采用HPLC法初步分析了厚樸酚性成分的差異性與其質(zhì)量的相關(guān)聯(lián)系。除厚樸酚、和厚樸酚外，辣薄荷基厚樸酚是近年來從厚樸中分離得到的另一個(gè)同樣具有抗炎抗菌、細(xì)胞毒作用的木脂素成分[13-15]，由于其良好的藥理活性，日本學(xué)者已經(jīng)可以通過化學(xué)手段進(jìn)行其結(jié)構(gòu)的合成[16]，而天然的辣薄荷基厚樸酚在厚樸藥材中具體的含量分布情況未見報(bào)道。趙慧等[17]通過液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜技術(shù)對凹葉厚樸不同規(guī)格藥材的差異化學(xué)成分進(jìn)行分析，結(jié)果辣薄荷基厚樸酚可作為不同規(guī)格之間的差異性成分，基于此，非常有必要建立辣薄荷基厚樸酚的含量測定方法，因此本實(shí)驗(yàn)利用UPLC首次建立了同時(shí)測定厚樸藥材中和厚樸酚、厚樸酚和辣薄荷基厚樸酚的含量測定方法，同時(shí)對3種酚類含量檢測結(jié)果進(jìn)行聚類分析，考察不同產(chǎn)地厚樸藥材中3種成分的含量，為全面控制厚樸藥材質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Acquity H-class型UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司，PDA檢測器，Empower 3工作站）；Mettler AE 240型1/10萬電子天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司)；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）

1.2 藥品與試劑

厚樸酚對照品（批號KS0912CB14，純度≥98.0%）購自上海源葉生物科技有限公司，和厚樸酚對照品（批號：T28O6B5149，純度≥98.0%）購自上海源葉生物科技有限公司，辣薄荷基厚樸酚（峰面積歸一化法，純度≥98.0%，實(shí)驗(yàn)室自制）。甲醇（色譜純，Thermo Fisher公司），純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），其它試劑為分析純。

1.3 藥材

試驗(yàn)用厚樸樣品采自湖北恩施，安徽潛山、浙江麗水，經(jīng)中國中藥公司中藥研究院趙潤懷研究員鑒定為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.和凹葉厚樸M.offcinalisRehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.，（表1）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品儲(chǔ)備液的制備

分別精密稱和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品25.34 mg、厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品25.26 mg、辣薄荷基厚樸酚11.70 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇適量，置于超聲波清洗機(jī)超聲溶解30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻。分別精密吸取和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 mL、厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液15 mL、辣薄荷基厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液12 mL于100 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度分別為0.203 mg·mL-1的和厚樸酚、0.152 mg·mL-1厚樸酚、0.056 mg·mL-1辣薄荷基厚樸酚混標(biāo)溶液。

表1 厚樸藥材樣品來源

2.2 供試品溶液制備

精密稱取厚樸藥材粉末樣品（過60目篩）約0.2 g，置于錐形瓶中，加25 mL甲醇冷浸24 h，過濾，置25 mL量瓶中，加甲醇溶液至刻度，搖勻備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH-Cl8柱（2.1 mm×50 mm,1.7 μm）；流動(dòng)相：A為0.2%甲酸水；B為甲醇；洗脫程序：0-2 min（65%-65%B），2-3 min（65%-75%B），3-5 min（75%-84%B），5-9 min（84%-90%B）；流速0.5 mL·min-1；柱溫35℃；檢測波長294 nm。

2.4 專屬性試驗(yàn)

分別吸取和厚樸酚、厚樸酚和辣薄荷基厚樸酚的混標(biāo)溶液和藥材供試品溶液各1 μL，在上述色譜條件下測定，結(jié)果3種被測成分在藥材供試品溶液色譜中與其他化合物分離均良好見圖1。同時(shí)供試品溶液中被測化合物的保留時(shí)間與3個(gè)對照品的保留時(shí)間一致，且從PDA獲取的被測成分與對照品的紫外光譜圖一致，說明該方法具有良好的專屬性。

表2 和厚樸酚、厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚的回歸方程、相關(guān)系數(shù)（R2）及線性范圍

圖1 厚樸藥材的UPLC

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對照品溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 μL注入高效液相色譜儀分析，記錄厚樸酚、和厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚的峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量（μg，X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)作圖，進(jìn)行線性回歸（表2）。

2.6 精密度試驗(yàn)

將混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次1 μL，記錄和厚樸酚、厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚的峰面積并計(jì)算RSD，結(jié)果分別為0.14%、0.12%和0.23%，表明儀器精密度較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液分別于0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，進(jìn)樣體積1 μL，記錄和厚樸酚、厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚的峰面積并計(jì)算RSD，結(jié)果分別為0.92%，1.15%和1.19%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批厚樸藥材樣品（編號6），按“2.2”項(xiàng)下方法操作，平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測定并計(jì)算，結(jié)果和厚樸酚平均含量，厚樸酚平均含量、辣薄荷基厚樸酚平均含量分別為18.87，14.68，4.76 mg·g-1，RSD分別為1.04%，1.15%和1.14%，表明本法的重復(fù)性較好。

表3 和厚樸酚、厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚回收率

2.9 加樣回收率

分別稱取已測定含量的厚樸藥材（過60目篩）約80 mg共9份，精密稱定，分別按80%、100%、120%比例加入各對照品適量，制備供試品溶液，測定3種成分的加樣回收率（表3）。

2.10 含量測定

精密稱取不同產(chǎn)地采集的厚樸藥材粉末樣品（過60目篩）0.2 g，分別按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以回歸方程計(jì)算含量（表4）。結(jié)果顯示和厚樸酚含量最高達(dá)2.65%，最低為0.24%；而厚樸酚含量維持在1.46-2.68%，15批次樣品兩者含量總和均高于2.0%，符合于2010年版《中華人民共和國藥典》的要求。辣薄荷基厚樸酚的含量最高達(dá)0.87%，最低為0.05%。

2.11 聚類分析

對3個(gè)不同產(chǎn)地的15批次厚樸中3種木脂素成分含量使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用組間連接處理方法，距離的計(jì)算方法為Euclidean距離，進(jìn)行層次聚類分析（圖2），結(jié)果顯示15個(gè)樣本可分3大類，其中浙江麗水產(chǎn)凹葉厚樸（編號11-15號）聚為第一類；湖北恩施產(chǎn)厚樸（編號1、2、5、6）聚為第二類；安徽潛山產(chǎn)厚樸（編號7-10）以及湖北恩施編號3和編號4樣品聚為第三類。而本次實(shí)驗(yàn)中采集的湖北恩施和安徽潛山的厚樸藥材均為厚樸品種Magnolia officinalis Rehd.et Wils.，根據(jù)聚類結(jié)果最終這兩個(gè)產(chǎn)地的樣品聚為一大類，完全和采集于浙江麗水的凹葉厚樸M.offcinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.區(qū)分開來，可見，來源于藥典的這兩個(gè)品種還是存在一定的區(qū)別，傳統(tǒng)厚樸道地產(chǎn)區(qū)的劃分具有合理性。

2.12 3種酚類含量的相關(guān)分析

厚樸酚與和厚樸酚作為厚樸中主要的活性成分已被證實(shí)，現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》以和厚樸酚、厚樸酚的總含量為控制指標(biāo)。辣薄荷基厚樸酚作為厚樸中的次生代謝產(chǎn)物，與厚樸酚在結(jié)構(gòu)上有相似性，且同樣具有類似的藥理活性，通過相關(guān)分析可大體反映出3種酚類成分含量之間的關(guān)系。本文通過SPSS 22.0軟件，采用Person相關(guān)分析對厚樸樣本中的3種酚類成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析，數(shù)據(jù)見表5。從表5中可以看出，辣薄荷基厚樸酚的含量與厚樸酚、和厚樸酚以及二者的總量均有顯著的正相關(guān)性，而這種含量上的正相關(guān)性為辣薄荷基厚樸酚與厚樸酚、和厚樸酚在藥理活性的相似性以及協(xié)同作用方面提供了一定的線索。

3 討論

結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[18-20]，分別考察了甲醇-水，乙腈-水、甲醇-0.2%甲酸、甲醇-0.2%磷酸水、甲醇-0.2%醋酸、乙腈-0.2%甲酸及乙腈-0.2%磷酸等系統(tǒng)梯度洗脫，結(jié)果顯示采用甲醇-0.2%甲酸水的梯度洗脫各個(gè)峰的峰型較好且有良好的分離效果，故選擇甲醇-0.2%甲酸水的梯度洗脫為洗脫條件。研究中分別考察了230、260、294和310 nm下3種成分的吸收情況，最后選擇294 nm為測定波長。

表4 15批樣品含量測定表(n=2)

圖2 3種木脂素成分系統(tǒng)聚類分析結(jié)果

表5 3種酚類成分含量的相關(guān)性

由于3種木脂素成分均為脂溶性成分，故在提取溶劑的考察中，分別考察以甲醇、95%乙醇、無水乙醇作為提取溶劑的提取效果，結(jié)果顯示3種溶劑提取效果相當(dāng)，采用甲醇提取的雜質(zhì)峰相對較少，因此選擇甲醇為提取溶劑。關(guān)于提取方法選擇，分別考察了甲醇24 h冷浸法（藥典法）、甲醇超聲提取1 h、甲醇水浴回流提取2 h等不同方法，結(jié)果表明藥典法甲醇冷浸24 h效率最高。對溶劑量進(jìn)行考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，溶劑體積為25 mL時(shí)可完全提取3種待測成分，故選擇25 mL甲醇作為溶媒用量。

厚樸為臨床常用中藥，使用廣泛，全面控制厚樸藥材的質(zhì)量是控制和保障其制劑質(zhì)量的有效手段之一。厚樸的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)以湖北恩施為中心，產(chǎn)于湖北、四川的厚樸又稱為“川樸”，而產(chǎn)于浙江、福建等地的稱為“溫樸”，這與聚類分析的結(jié)果一致，而潛山所產(chǎn)厚樸從分析結(jié)果上看，辣薄荷基本厚樸酚的含量也相對較高，這可能與樣本生長年限較長有關(guān)。然而，來源于不同品種的厚樸聚為不同類，說明厚樸與凹葉厚樸之間存在較大的差異，這與張春霞[18]報(bào)道的相對于樹齡與產(chǎn)地，種源（品種）對厚樸藥材質(zhì)量的影響較大的結(jié)論相符合。由于樣品收集有限，本次只選擇了3個(gè)產(chǎn)地主要產(chǎn)區(qū)15個(gè)樣本，未對全國其他產(chǎn)區(qū)如廣西資源，湖南道縣、陜西安康等地樣品進(jìn)行采集和測定，一定程度上影響了研究的深度。厚樸作為皮類中藥，并且作為國家二級保護(hù)中藥材，一般采收年限在15年之上，且藥典收載的厚樸還存在著不同的入藥部位，即不同的商品規(guī)格（枝樸、根樸、篼樸、筒樸），因此辣薄荷基厚樸酚作為厚樸藥材額外的質(zhì)量控制指標(biāo)在其他產(chǎn)區(qū)樣本、不同藥用部位以及不同樹齡的分布和含量累積情況將是下一步研究的重點(diǎn)。