基于代謝組學的中藥質量及機制研究＊

賈志鑫，徐文娟，馬愷悅，肖紅斌

（1.北京中醫藥大學北京中醫藥研究院 北京 100029；2.北京中醫藥大學中藥分析與轉化研究中心 北京 100029；3.北京中醫藥大學生命科學學院 北京 100029；4.北京中醫藥大學中藥學院 北京 100029）

中藥是中醫臨床應用的重要形式，是辨證論治的集中體現，其多藥物、多成分的組方原則決定了其藥理作用機制的多靶點、多途徑等特點。中藥的活性并不是簡單多成分藥理指標的疊加，而是不同活性成分相互作用（藥效上的協同或拮抗、毒性上的降低或增強），最終以網絡形式表達的整體藥效作用。中藥的多組分特征增加了研究的復雜性，使其質量控制、藥效物質基礎及作用機制研究緩慢，成為制約中醫藥現代化和國際化發展的瓶頸。建立符合中藥特征的研究模式，有效控制中藥質量，系統闡釋中藥的科學內涵，是中藥現代化的關鍵科學問題之一。

系統生物學于1998年由美國的Leory Hood教授系統提出[1]，它是研究生物系統組成成分的構成與相互關系的結構、動態與發生，以系統論和實驗、計算方法整合研究為特征的生物學。代謝組學是系統生物學的重要組成部分，它興起于上世紀90年代中期且發展極為迅速。代謝組學把機體作為一個完整的系統來研究，具有整體性、系統性的特點，其研究思路與中醫藥的整體觀和辨證論治特點吻合，在中藥物質基礎研究、質量控制、藥效作用機制、毒性機制、安全性評價等多個領域展現出了廣闊前景，為中藥復雜系統研究和新藥研發提供了有力手段。

傳統中藥研究多基于“還原論”進行。這種方法雖然能研究的較為全面，但耗費時間較長、成本較高，且針對中藥的研究最后往往都變成了中藥零部件研究或單體成分藥研究，不符合中藥“系統性、整體性”的特點。隨著組學技術的發展和人們對中藥系統性認識的不斷加深，研究思路正從還原性研究轉化為系統性研究，實現從描述到預測的飛躍。基于“系統論”的中藥研究可借助代謝組學方法重點從藥物作用的通路、網絡入手進行整合研究，以闡明中藥作用機制，把控中藥質量，推動中藥組合藥等新藥研發。

1 代謝組研究進展

代謝組學（metabonomics/metabolomics）于1999年由Nicholson[2]首次提出，是研究生物體系受刺激或擾動后（如將某個特定的基因變異或環境變化后）其內源代謝物種類、數量及其變化規律的科學。代謝組學是系統生物學的一個重要組成部分。系統生物學主要由基因組學（genomics）、轉錄組學（transcriptomics）、蛋白質組學（proteomics）和代謝組學等構成。雖然基因組和蛋白質組體現了生物功能代謝的上游信息，但二者的功能缺失可由其它基因或蛋白質的存在而得到補償，其結果不一定會反映在生物體表型上。而小分子物質的產生和代謝才是機體復雜代謝反應的最終結果，它們能更直接、更準確、無歧視的反映生物體的生理病理狀態。代謝組學在多種領域都有較好的應用，其中以生物醫學領域最為廣泛，常被用于發現疾病標志物、研究發病機理、及評價藥物療效等。

國外有學者把代謝組學分為4個層次，即代謝靶標分析（Target Analysis）、代謝輪廓分析（Metabolic Profiling）、代謝指紋分析（Metabolic Fingerprint-ing）和代謝組學[3,4]。這4個層次由單一靶目標定量到多目標定量，由結構或性質相關的一類化合物的輪廓分析到全局化合物的輪廓分析，體現了代謝組學技術的發展及研究理念的提升。代謝組學的研究策略主要包括代謝指紋譜分析和代謝靶標分析。其中代謝指紋分析旨在對生物樣本中所有代謝物進行分析，從整體的角度觀測生物體系對外界刺激的代謝變化響應，進而溯源上游的蛋白質組乃至轉錄組的調控機制。而代謝靶標分析則聚焦特定的代謝通路，一次完成多種化合物定量分析。早期代謝組學研究以疾病標志物發現為主要應用方向，而代謝指紋譜分析“俯瞰”生物體系代謝物整體變化，是早期最主要的研究方式。隨著對復雜機體逐步深入的認識，代謝組學研究從疾病標志物發現轉移到代謝機制研究，代謝靶標分析以其在定量方面的優勢，成為目前代謝組學研究的主流方式。

1.1 代謝組學標準化研究

完整的代謝組學包括樣本準備、數據獲取、標志物分析和網絡分析這幾個步驟。代謝組學技術和操作條件多種多樣，而大量樣本經過前處理等環節所產生的誤差以及在數據獲取和分析中所引入的不確定性使研究者越來越意識到分析流程標準化的重要性。Zeper A等[5]進行了代謝組學樣品穩定性研究，發現不同儲存條件下有36個代謝物差異顯著（P＜0.05），甚至有代謝物在-80℃保存5年后變化超過100倍，證明代謝組學標準化勢在必行。Lindon JC等[6,7]對代謝組學規范化研究進行了詳細的總結，并制訂和發布了有關代謝組分析方法的標準化報告的詳細草案。Bino RJ等[8]提出了MIAMET的代謝物組學數據模式，除樣品收集、處理外，還涉及數據分析等各環節。Xu GW等長期致力于樣品標準化獲取及處理的研究，考察了不同采血管、凍融次數、放置時間等因素對結果的影響[9]，比較了血漿、血清所獲得結果的區別[10]，為樣本標準化采集提供了參考方案。隨著研究的不斷深入，越來越多的研究者發現生物標志物具有難以重現甚至趨勢相反等現象。Xu GF和Zhang ZJ等[11]對這一現象進行了深入研究，系統比較了歸一化數據預處理方法對生物標志物篩選的影響，初步揭示了“代謝組學標志物篩不對”、“實驗室間可比性差”的原因，對于組學數據分析標準化具有積極貢獻。

1.2 高覆蓋度的數據獲取

樣品數據獲取是代謝組學的核心關鍵技術，現階段技術手段以LC/MS、GC/MS以及NMR應用最為廣泛。因各種技術均有相應的適用范圍，且內源性化合物種類繁多特點各異，并不能真正完全的表征全部內源性代謝物。如何開發高覆蓋度的數據獲取策略成為研究的難點與熱點。整合多種技術的代謝組學分析平臺（如靶向與非靶向技術結合），多種分析方法整合應用以及計算機輔助文獻挖掘等方法成為新的發展趨勢。Xu GW等[12]結合UHPLC-HRMS和UHPLC-MS/MS的優勢開發了一種高覆蓋度的偽靶向脂質組學分析方法，通過3377個靶向脂質離子對測定了超過7000種脂質化合物，為代謝組學高覆蓋度數據獲取提供了有力借鑒。如何囊括低豐度、高活性的代謝物信息也是代謝組學高覆蓋度數據獲取的發展方向。Zhang JL等[13]針對脂肪酸類化合物建立了衍生化方法，使該類化合物的質譜檢測靈敏度提升了2-3個數量級。Li L等[14]建立了化學同位素標記液質聯用方法用于人尿液中羥基化代謝物的高通量表征，可初步鑒定3093個峰中的2304個代謝物。以上方法提高了檢測靈敏度，擴充了代謝組學所覆蓋化合物的廣度，以期盡可能更多、更完整的表征生物樣品中的內源性代謝物信息。

1.3 標志物識別及網絡分析

代謝組學數據分析通過化學計量學與多元統計學分析方法相結合，對機體內代謝物進行全面分析，表征差異性生物標志物，探索其與生物體產生的生理、病理變化或藥物治療下生物體整體狀態改變的相關性[15]。

標志物判別常采用主成分分析（PCA）、層次聚類分析（HCA）、非線性影射（NLM）等非監督分類方法，以及偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）、神經網絡（NN）等監督分類方法，其中PCA和PLS-DA應用較為廣泛。劉昌孝等[16]對化學計量學在代謝組學中的應用進行了系統性的研究。標志物的鑒定仍是目前的最具有挑戰的工作之一，研究者為此開展了多方面研究，建立起系列數據庫用于精確分子量比對鑒定，如METLIN（www.metlin.scripps.edu）、MassBank（www.massbank.eu/MassBank/）、HMDB（www.hmdb.ca）等。Brüschweile R等[17]建立了MS/NMR聯用的代謝產物快速鑒定策略，鑒定了大腸桿菌提取物中氨基酸、核酸、核苷酸等化合物。Xu GW等[18]成功的將高分辨質譜、微分離制備和色譜技術相結合，解析了能夠表征糖尿病的代謝產物的同分異構體。后續在此基礎上不斷完善，形成標準操作規程并建立起約2000個化合物的實驗室代謝產物數據庫，成功應用于血漿中202個代謝產物的鑒定[19]。

經過近二十年的發展，代謝組學已由最初的差異代謝物發現、潛在標志物篩選進入到更深層次的相關代謝通路分析，且隨著生物大數據時代的來臨，代謝組學后期數據處理正逐步深入，嘗試與網絡藥理學相結合，探討生物病理、藥物治療的機制研究，構建標志物與標志物、標志物與靶點以及靶點之間相互作用的網絡，觸及探究生命的本質。基于以上理念，本課題組[20]探索性的通過代謝組學獲得丹紅注射液針對巨噬細胞泡沫化模型差異代謝物，結合網絡藥理學構建“活性單體藥效靶點－疾病通路蛋白”相互作用網絡，研究丹紅注射液的藥效傳遞特征途徑。Zhang ZJ等[21]利用代謝組學進行雄黃毒性標志物研究，在整合LC-MS、GCMS、NMR技術后得到50個生物標志物，并構建了受其影響的代謝網絡，指征到三羧酸循環、色氨酸代謝、能量代謝三個通路。Yao L、Wang XJ和Lu HT等[22]定義了精準修飾代謝組學這一策略，靶向關注目標代謝通路化合物，同時利用質譜進行同位素示蹤，然后分析關鍵調控基因和相關酶，深入研究致病性大腸桿菌引起尿路感染的診斷、病源機理，并助力創新藥物的發現。

隨著儀器靈敏度的不斷提升、高通量組學技術的不斷進步、計算方法與能力的迅速發展、開源數據的不斷積累，代謝組學進入了全新的生物信息時代，其在中藥相關領域的研究也迎來了更好的發展契機。而如何實現代謝組學在中藥質量標準及機制研究中的應用是所面臨的關鍵問題。本課題組為解決上述關鍵問題進行了一系列的研究和探索，以期推動代謝組學在中藥研究中的應用，助力中藥新藥研發，推動中藥國際化現代化進程。

2 代謝組學在中藥研究中的應用

2.1 中醫藥整體評價

中醫證候研究是指將中醫整體觀和中醫辨證施治觀相結合，綜合性的評價中醫診治疾病的本質與作用規律，是中醫基礎研究中的核心研究內容，也是中醫學對疾病的一種特殊的研究和處理方法[23]。代謝組學反映的是人體整體代謝網絡對所有擾動因素進行整體回應的結果，可能更接近于中醫“證”的內涵[24]。Wang GJ等[25]開展了臨床高血壓病人中醫辯證分型（包括肝火亢盛、痰濕雍盛及陰虛陽亢三型）的血清代謝組學研究，利用PCA和馬氏距離法可明顯區分3種不同證型的高血壓病人，且后者可在一定程度上顯示3種證型的發展關系，符合中醫辨證分型的理論。此項研究證明了利用代謝組學研究技術揭示中醫“證”本質的可能性。本課題組[26-28]基于代謝組學進行糖尿病中醫證候研究。將氨基酸代謝輪廓譜與脂肪酸代謝輪廓譜作為研究對象，通過對這兩類代謝成分的定量及關聯研究，尋找糖尿病及其中醫證候的物質基礎，以期促進糖尿病中醫診斷科學化、規范化。

中藥則是在中醫辨證施治、辨病理論基礎上，施以根據一定組方原則組成的多味中藥方劑或單味藥，是中醫臨床治療疾病的主要形式。基于代謝組學對中藥進行整體性評價，既符合中藥多靶點、多途徑的復雜作用特點，又契合中醫證候整體觀、辨證治療的理論。Wang XJ等[29]運用UPLC-MS技術研究溫心方治療心氣虛證的藥效物質基礎，結合多變量統計學分析方法表征了17個特異性生物標志物及其代謝網絡，包括硬脂酸、尿酸、左旋肉堿、3-羥基犬尿氨酸等。結果顯示溫心方治療心氣虛證的作用途徑主要與生物體內糖酵解、不飽和脂肪酸的合成代謝、糖異生代謝和嘌呤代謝密切相關，科學闡釋了中藥辨證施治的作用機理。本課題組[30]進行了基于代謝組學的擇時合用中藥抗腎虛衰老研究。設立正常組、腎衰老模型對照組、腎衰老模型給藥組（不同時間給予不同中藥組合，共4組），創新性的結合GIOS變量篩選并進行療效評價，發現可顯著區分對照、模型及給藥組，且不同藥物干預組變化趨勢不同，體現了代謝組學對中藥的整體性評價。

2.2 中藥質量標志物篩選

圖1 基于代謝組學的中藥質量標志物篩選策略

傳統的中藥質量標準的研究手段通常選擇含量高、有一定特征性的成分作為質控指標，但缺乏專屬性、溯源性和功能屬性相關性。代謝組學反映有機體整體代謝網絡對所有擾動因素的完整、無歧視回應的結果，全面考慮影響中藥材質量的主要因素諸如品種、氣候、產地、采集季節以及炮制方法等。應用該技術進行專屬性質量標志物的篩選，可得到更加專屬穩定、功能屬性相關、遵循組方配伍理論的指標成分。中藥質量標志物這一概念由劉昌孝院士[31]提出并獲得國內外眾多學者認可，意在針對目前中藥質量標準存在的不足，形成針對反映中藥安全性和有效性的標示性物質進行質量控制的重要新手段。

本課題組在前期研究工作的基礎上，結合代謝組學、網絡藥理學的分析特點以及質量標志物的內在屬性，提出了基于代謝組學的質量標志物篩選策略（圖1）。首先，借助本課題組前期建立的高靈敏的檢測分析技術，對樣品進行全成分分析，隨后進行標志物的篩選，該部分作為本策略的核心板塊，分別從穩定性、專屬性、功效相關性和代表性四部分對質量標志物進行篩選研究，最后通過定量分析、聚類及主成分分析等驗證所篩選的質量標志物。

基于以上研究策略本課題組開展了人參的質量標志物篩選研究[32]。目前藥典中規定的人參的質控指標為人參皂苷Rg和Re，而與人參相同種屬的三七、西洋參和珠子參藥材所含化學成分相近，在藥典質控指標近似的情況下無法準確區分。因此以人參為例借助代謝組學篩選其特征質量標志物。首先，采用高靈敏采集方法對42個樣品進行全成分分析，共解析出1634個成分。然后，借助代謝組學處理技術排除冗余成分，并通過分子離子排重、成分等操作，保留并確定人參分別區別于三七、西洋參、珠子參的關鍵專屬性成分。進而，分別對保留的關鍵化合物進行相關性分析，重點關注豐度較高并且與其它大部分專屬性成分含量呈正相關的成分作為人參的候選指標成分。綜合考慮指標成分穩定性、含量等問題，分別選擇竹節參皂苷Iva、人參皂苷Rf和人參皂苷Rc作為人參區別三七、西洋參和珠子參的指標性成分。為了驗證所選擇指標成分的合理性，用人參的上述3個指標成分對人參和西洋參、珠子參、三七這四種相似藥材進行PCA分析和聚類分析，結果顯示四種藥材各自劃為一類，驗證了借助代謝組學技術所選擇指標成分具有合理性。

中醫臨床常以中藥材炮制品入藥，但炮制前后化學成分往往會發生改變，從而導致藥性藥效的變化。因此，炮制前后質量標志物的確定對于臨床用藥療效和安全至關重要。本課題組以生、熟大黃為例，運用代謝組學方法尋找炮制前后的質量標志物[33]。一方面通過靶向代謝組學，測定大黃炮制前后藥典指標含量的變化情況；另一方面基于非靶向代謝組學，進行全譜數據差異性分析，從大黃化學成分中找尋受炮制影響顯著的化學成分。靶向數據表明藥典中4個指標性成分在炮制后含量下降幅度微小；非靶向數據表明模式識別可發現大黃炮制后有126個特征峰顯著變化，其中124個峰顯著下降，2個峰顯著升高。大黃炮制前后變化最顯著的化合物為原矢車菊素B5（或為其異構體），炮制前后含量下降顯著的蒽醌類化合物為大黃素-8-O-（6'-O-丙二酰基）葡萄糖苷（或為其異構體）。該結果提示，代謝組學可助力于藥材炮制前后質量標志物的篩選，為炮制藥材質量標準的建立提供科學依據。

圖2 基于細胞代謝組學的中藥活性成分肝毒性機制探討

2.3 中藥作用機制研究

2.3.1 藥效作用機制研究

中藥作用機制的研究是闡明中醫辨證論治原理和推進中醫藥現代化的重要部分，不僅為中醫臨床合理使用方藥提供理論支撐，而且為新藥研發提供科學依據[34]。劉昌孝等[35]從代謝物組成分和量的經時變化發現鉤藤等多味中藥的療效生物標記物，認為藥物的整體作用所產生的生物化學物質（神經遞質）是其藥效的物質基礎，證明多動合劑的作用機制可能與DA受體變化有關，開創性的探索了中藥方劑作用機制的研究。

動脈粥樣硬化是眾多缺血性心腦血管疾病的重要生理病理基礎。近年來本課題組基于代謝組學系統揭示動脈粥樣硬化及腦中風的代謝異常情況，并以此為基礎開展丹紅藥效靶點發現及量效調控機制研究，對于指導臨床診斷以及新藥研發都具有重要意義。以巨噬細胞泡沫化作為動脈粥樣硬化早期病理模型開展代謝組學研究，實現了胞內163個代謝物的分析，最終篩選出9個重要的生物標志物及6條代謝通路。其中花生四烯酸代謝的貢獻最大，其關鍵代謝物AEA的含量上調，它的代謝產物均呈現明顯的下調趨勢，結合Western blot結果證明AEA代謝受阻是巨噬細胞泡沫化的主要特征[36]。結合網絡藥理學構建蛋白互作網絡，發現并驗證PTGS2（前列腺素內過氧化物酶2）為疾病關鍵通路蛋白，Tan IIA-EDN1-PTGS2-AEA為Tan IIA藥效傳遞特征途徑。此外課題組采用MCAO大鼠模型，基于代謝組學系統闡釋腦缺血代謝異常狀況[37]以及丹紅注射液（DHI）治療腦缺血的量效調控機制。選擇腦缺血特征網絡中41個關鍵代謝物開展靶向代謝組學研究，篩選出DHI不同劑量的特征代謝標志物。評估劑量相關藥理模塊中節點重要性明確Gly和Glu是劑量相關模塊網絡中最重要的節點。進而發現并驗證Glu-GLT-1/Gly-GlyRα是DHI調控的核心模塊單元[20]。

2.3.2 毒性作用機制研究

隨著中藥研發的現代化和國際化，其安全性倍受關注。與中藥藥效具有多靶點的特點相類似，中藥毒性作用也具有該特點，應用反映整體思想的代謝組學評價中藥的毒性，對中藥毒性進行系統、全面、整體的評價研究，對于建立現代中藥毒理評價體系，確保中藥的合理、安全、有效用藥，指導臨床用藥劑量和時間具有積極的意義。如針對傳統有毒中藥雷公藤，Su MX等[38]通過NMR技術發現內源性代謝物檸檬酸、α-酮戊二酸、牛磺酸、氮氧、三甲胺(TMAO)和葡萄糖等發生了明顯變化。推測其毒性機制可能是其損傷了肝線粒體功能及干擾了能量代謝中的三羧酸循環，并導致葡萄糖代謝的紊亂。

本課題組[39]用大黃蒽醌單體干預制備肝損傷細胞模型，進行非靶向代謝組學分析，對顯著變化的潛在生物標志物及其代謝通路進行研究，探討可能的肝損傷機制。對正常組細胞和大黃素干預組細胞模型進行代謝物模式識別，鑒定得到26個與大黃素潛在肝損傷密切相關的代謝物，可明顯分為2類：以谷胱甘肽（GSH）為代表的氧化還原相關代謝物和與十八碳脂肪酸代謝相關的脂質及長鏈脂肪酸氧化產物。在此研究中，我們首次發現了大黃素與半胱氨酸形成的加和物，該加合物具有時間依賴、劑量依賴性。半胱氨酸與肽GSH代謝密切相關，數據表明，谷氨酰半胱氨酸合成酶γ-GCS在低濃度大黃素干擾時活升高，而中、高濃度時活性顯著下降。同時，半胱氨酸的代謝物是牛磺酸，而牛磺酸是合成膽汁酸的主要成分，其含量隨著大黃素濃度的增加呈現顯著性下降。因此我們推測，大黃素-半胱氨酸加和物的生成是肝毒性發生的重要觸發點。

3 討論及展望

代謝組學技術正處于蓬勃發展的時期，但仍面臨著諸多不足，如不能完全鑒定生物有機體的全部小分子化合物、無法完成所有目標化合物的定量測定工作、不同實驗室之間仍然存在測定結果和分析結果偏差等。科研工作者已經意識到相關不足并向著這些方向不斷努力，相信定會逐步提升檢測靈敏度和化合物覆蓋范圍，也勢必會迅速擴充現有資源，不短突破新的認知。而現代醫藥研究所貫徹的“單靶標、單疾病、單藥物”研究模式正面臨耗費巨大、成功率低的困境，這為中藥的發展提供了新的契機和挑戰。如何將中藥用科學的、現代的語言進行闡釋，完善其質量標準，弄清其作用機制，是中醫藥現代化、國際化所亟待解決的問題。將代謝組學系統性、整體性的特點應用于中藥研究，在科學技術創新的基礎上又能融合中醫藥辨證施治、整體調節、陰陽調和等傳統特點，將大力推進中藥現代化發展，形成一條具有特色的中藥新藥研發之路。