基于Poly-PK策略的多組分藥物研究＊

王 洋，溫麗榮，林思彤，池 逸，林景超

（麥特繪譜生物科技（上海）有限公司 上海 201203）

近年來，隨著藥代動力學領域新理論、新方法的涌現，研究者已經認識到僅用單體化合物或者幾種有效成分進行藥代動力學研究只能反映藥物單體或少數有效成分本身的藥代動力學特點，不能反映多組分藥物整體藥代動力學特征。單成分、單靶點的藥物藥代動力學研究模型在多組分藥物藥代動力學研究中存在很大的局限性，而從單一組分到多組分、單靶點到多靶點的藥代動力學研究策略則有待進一步開發與完善。本文重點介紹運用代謝組學技術進行多組分藥代動力學研究策略（Polypharmacokineties，Poly-PK），并對該研究策略的發展前景和技術挑戰進行展望。

1 多組分藥代動力學研究現狀

近幾十年，國內學者運用各種思路與新技術對中藥展開藥代動力學探索性研究，在臨床藥物評價中經常面臨的是機體內在因素（年齡、性別、疾病等）和外在因素（藥物相互作用等）的相互作用，該作用將影響藥物劑量-效應和暴露量-效應關系[1]。因此，目前研究多組分藥物藥代動力學可采用藥代動力學-藥效動力學結合模型（pharmacokinetics-pharmacodynamics，PKPD）、生理藥代動力學模型（physiologically based pharmacokinetic，PBPK）、藥代標示物（pharmacokinetic markers，PK-Markers）等。

1.1 多組分PK-PD結合模型

近年來，采用PK-PD結合模型研究機體對藥物的作用以及藥物對機體的效應已成為多組分藥物藥動學研究的熱點方法[2]。藥動學和藥效動力學是按時間進行的兩個密切相關的動力學過程，PK是研究治療劑量下“血藥濃度-時間”的關系，而PD則是研究治療劑量下“藥效-血藥濃度”的關系。將二者相結合進行研究不僅能闡明藥物在體內動態變化的規律性，也能揭示藥物在效應部位作用的特性，是研究藥物劑量與藥物效應之間定量關系的有效工具，能較客觀地闡明“時間-濃度-效應”之間的三維關系，在優選臨床用藥劑量、提高療效和減少毒副作用等領域具有重要的參考價值[3]。楊永茂[4]以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚為PK指標，以腫瘤壞死因子α、內毒素和二胺氧化酶為PD指標，以作用機制為導向，以結構方程和微分動力系統為方法，為中藥多成分多效應之間的關系研究提供一定的借鑒意義。杜力軍[5]等利用PK-PD結合模型分析以黃芩苷、小檗堿和蛇床子素作為黃芩、黃連、獨活等中藥的有效部位群的代表成分，研究三者的代謝過程與發熱大鼠體溫變化的關系。但是，PK-PD結合模型研究仍面臨需要解決的問題，如多組分中藥成分不明確或者干擾因素太多，如何對有效效應物質、有效成分、無效成分3個部分進行整體性研究；如何選擇藥效指標直接反映治療效果；此外，各成分之間相互影響，同一種有效成分在不同中藥中因所處環境不同，其藥動學參數也各不同[6]。因此建立符合中醫藥理論的多組分、多靶點的PK-PD結合模型是中醫藥現代化研究中的一個重要課題。

1.2 基于生理的藥代動力學模型（PBPK）

PBPK是根據人體生理系統參數、藥物理化性質以及PK數據整合分析以提早預測人體內的PK及藥效學特征。模型主要包括三個部分：系統特異的參數（血流速度、組織組成等）、藥物特異的參數（蛋白結合率、酶動力學參數等）和模型結構[7]。PBPK模型結構是根據每個器官中的藥物濃度變化作為一個模塊，然后將所有模塊中藥物濃度和血藥濃度的定量關系建立整體模塊來實現對全身組織器官中藥物濃度進行動態描述。因此，利用PBPK模型對藥物藥代動力學性質進行篩選；通過結合體外數據和生理放大系數，PBPK模型預測藥物在動物和人的整體藥代動力學行為；結合體外代謝實驗，可提前預測藥物相互作用；在臨床階段，PBPK模型結構可以預測人體不同生理條件（不同年齡、不同疾病狀態、不同種族）下的PK及藥效特征[8,9]。He[10]等基于多組織/器官全體PBPK模型，以懷孕相關的生理參數，用于描述孕婦參考藥物（二甲雙胍、地高辛等）的PK，與非懷孕或產后（PP）婦女的PK相比，預測藥物（二甲雙胍、地高辛、咪達唑侖等）在孕婦中潛在的暴露變化。也有人對腎衰竭患者進行PBPK預測[11]，該研究建議建立并驗證藥物模型和腎衰竭患者生理學模型，整合可體現生理改變影響藥物PK特征的關鍵藥物參數和生理學參數，經過臨床數據驗證后，才可用于腎衰竭患者PK特征預測。

1.3 藥代標示物（PK-Markers）

PK-Markers研究方法中的標示物需要滿足三個條件：首先，標示物存在于所研究的藥物中或者藥物相關的代謝物；其次，標示物與藥效作用相關，在體內暴露顯著；最后，標示物可以用現代分析方法檢測且在不同時間點下濃度不同[12]。該法突出了代謝物的概念，即多組分藥物藥代動力學研究應該基于血清中的、有代表性的、與藥物效應相關的組分進行分析[13]。因此，尋找合適的標示物成為該方法的重點。李川等[14]基于液質聯用技術建立同時檢測16種人參皂苷成分的方法，并研究了大鼠口服三七提取物后人參皂苷在體內的吸收與分布情況，對三七中的PK markers進行了鑒定，研究結果顯示原人參二醇類人參皂苷GRa3、GRb1、GRd可作為表征三七水提物經口服后合適的PK markers。

2 Poly-PK策略提出

近十幾年，代謝組學技術（LC-MS、GC-MS和NMR等）的成熟與應用，代謝組學研究結果的準確性和精密度得到大幅提高[15]，代謝組學不僅可以同時檢測成百上千的小分子代謝物，利用生物信息方法還可以系統地闡釋給定條件下生物機體內源性代謝物譜的動態變化及其與外源性干擾之間的關系[16]。因此，這種外源性物質及其代謝產物在生物體內隨時間變化過程的代謝組學研究更能滿足PK研究目的[17]。

針對傳統中藥PK發展的瓶頸問題，如采用單一或若干成分的傳統PK方法來研究多組分中藥PK并不契合實際[18]，多組分藥物中各成分之間相互影響應該如何體現[19]，賈偉研究團隊逐步提出了多組分中藥PK研究新策略即Poly-PK研究策略。該策略是利用代謝組學技術，對藥物自身的化學成分、不同時間點體內產生的次級代謝成分，以及不同時間點生物體的內源性代謝物3個水平同時進行絕對定性、定量檢測，聯合生物信息學方法對數據進行差異性和關聯性分析比較，在分子水平上刻畫多組分藥物在體內的整體、動態的代謝和相互作用過程，充分體現復雜藥物成分的整體、協同代謝效應[20,21]（圖1）。該研究策略與傳統方法相比，通過多組分中藥與代謝組學相結合監測藥物及機體用藥前后的代謝輪廓變化，實現了外源性物質與內源性代謝物之間的關系。其次，通過監測多組分藥物在機體吸收后發生生物轉化的代謝物，可以明確哪些成分是經過腸道菌群或者肝酶代謝產生的活性成分，有助于研究外源性物質的代謝通路，揭示多組分藥物的作用機制[22]。

3 Poly-PK策略初步驗證

圖1 Poly-PK研究策略

在這種新的研究策略下，首次考察普洱茶對人體代謝影響的研究，初步驗證了Poly-PK策略的有效性和可行性[23]。采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜儀（UPLC-QTOF/MS）和氣相色譜-飛行時間質譜儀（GC-TOF/MS）對普洱茶中的成分及尿液樣本進行代謝物分析鑒定，經過標準品鑒定，在UPLC-QTOF/MS和GC-TOF/MS兩個平臺分別鑒定出132種和58種物質。隨后對志愿者飲茶后0,1,3,6,9,12,24小時的尿液樣本中的代謝成分隨時間的動態變化進行了研究。將喝茶后不同時間點的尿液成分與0點尿液成分相比較，尋找到喝茶后引起改變的內源性物質118種。將喝茶后不同時間點的尿液與茶提取液相比較，得到尿液中有19種物質成分是從普洱茶中吸收的，還有26種物質成分是從普洱茶吸收并經體內代謝產生的。例如普洱茶中的咖啡因成分，在肝臟內經過細胞色素P450氧化酶體系的作用生成7-二甲基黃嘌呤、可可豆堿、茶堿三種成分，而可可豆堿、茶堿則進一步代謝為1,7-二甲基尿酸、1-甲基黃嘌呤，隨后生成1-甲基尿酸。通過該項研究確定了普洱茶中的成分、飲用后被機體吸收的成分以及對機體內源性代謝物的影響，利用生物信息學方法分析三者之間的相互作用，初步闡明了普洱茶的藥效物質基礎。也驗證了Poly-PK研究策略的有效性和可行性。

圖2 黃芪湯成分代謝變化

為了實現Poly-PK研究方法在中藥研究中的應用，隨后，采用相同策略及技術開展復方中藥黃芪湯I期臨床研究，對健康志愿者服用中藥黃芪湯（黃芪和甘草）前后藥物的多種化學成分在體內的吸收、代謝過程，以及對機體代謝網絡的影響進行了系統研究[24]。研究結果顯示黃芪湯包含有84種不同的化學成分，服藥前志愿者體內被檢測到292種體內代謝物，服藥后則被檢測到532種代謝物。對服藥前與服藥后各時間點的代謝物分析比較，發現其中有485種代謝物發生變化，并且這種變化與服用黃芪湯有關。經生物信息學分析得知，黃芪湯中有56種成分是以原型成分形式被吸收進入血液，還有292種新成分（黃芪湯的次級代謝物）是黃芪湯中的原藥成分通過機體代謝新產生的。另外，有166種體內的代謝物（內源性代謝產物）由于服用黃芪湯發生了顯著變化（圖2）。黃芪湯成分被體內吸收和代謝后，能顯著調節機體數十種內源性代謝物通路，也就是說黃芪湯中的成分在體內代謝過程的同時能對機體的代謝產生影響，從而產生了藥效作用。

此外，該研究將芒柄花黃素、甘草次酸、甘草素、甘草苷、異甘草苷進行了傳統PK分析，將Poly-PK分析結果與常規藥物PK結果進行比較，結果顯示兩種方式的處理結果基本保持一致，但是Poly-PK能夠提供的信息遠遠超出前者，在所檢出的化合物種類和數量、觀察到的藥物互相作用關系、以及獲得的人體代謝應答信息（藥效信息）方面是傳統PK方法無法比擬的。

這種新思路利用代謝組學技術，對藥物自身的化學成分、體內產生的次級代謝成分，以及生物體的內源性代謝物三組變量同時進行定性和定量檢測，聯合生物信息學方法對所獲得的數據進行差異性和關聯性的分析比較，獲得遠遠多于傳統藥代動力學方法所能得到的藥物代謝信息，體現復雜藥物整體成分的代謝效應。

4 展望

多組分藥物在疾病治療中的重要作用越來越凸顯[25,26]。藥物多成分、多靶點、多途徑的整體性特征決定成分/組分之間存在獨特的協同或拮抗作用，而這種協同或拮抗作用的研究則需要符合該特點的藥物研究模式。從Poly-PK概念的提出，到采用普洱茶在人群中開展驗證性研究，再到真正意義上的臨床藥代動力學研究，Poly-PK研究策略顯現出其有效性和可行性。Poly-PK整合了藥物分子輪廓分析技術和定量代謝組學技術，實現了同時對幾十種甚至上百種藥物成分的體內代謝變化以及人體的代謝應答（藥效）進行系統評價，展示了復雜藥物原型成分、經過代謝的次級成分、機體在藥物影響下發生的代謝變化以及三者之間的相互關系，在系統水平上描繪出復雜藥物系統的體內ADME全過程。

多組分藥物藥代動力學數據分析流程相對比較復雜，通常涉及多種不同的軟件，因此，賈偉團隊開發了相匹配的生物信息學軟件，R包—Poly-PK，采用10個函數實現了從數據預處理、差異性物質鑒定、分組、PK參數的計算、各種多元統計分析、相關分析、聚類分析等藥代動力學及對機體效應分析的全部功能，實現研究結果可視化。目前，該研究結果發表于生物信息學和計算生物學權威學術期刊Bioinformatics上（Bioinformatics.2017），該軟件包獲得軟件著作權，并已被CRAN收錄，可免費下載使用（https://CRAN.R-project.org/package=polyPK）[27,28]。

目前多組分藥代動力學研究尚處于探索階段，雖然前期已經取得很大進展，但仍然在許多方面存在著問題需要進一步解決。比如多組分藥物中，有的成分含量高，有的成分含量則很低，如何高通量準確的定性和定量藥物組分是系統、全面地分析藥效作用物質基礎的根本保證。臨床藥動學試驗中，采樣點的確定對藥代動力學研究結果具有重大的影響，中藥成分復雜，采樣點的設計要兼顧多個有效成分。同時，劑量不同藥動學特征也有可能不同，綜合上述問題，有時則必須進行多個臨床試驗[29]。因此，建立符合多組分、多靶點相互作用的專屬性藥代動力學研究與技術評價體系成為當前中藥藥代動力學研究的首要任務，將為中藥創新與現代復方中藥研發及臨床合理用藥提供有力工具。