響應面法制備格列美脲環糊精包合物

趙科 郭兆元 羅敏 徐文霞 劉源 任靜,*

(1 抗生素研究與再評價四川省重點實驗室，四川抗菌素工業研究所，成都大學，成都 610052；2 成都理工大學，成都 610059)

格列美脲(glimepiride, GM)是近年開發的臨床評價最優的磺脲類藥物，具有高效、長效、治療劑量少、不良反應小等諸多優點，臨床上應用廣泛除了降血糖的作用外[1-2]，有研究報導其有可以抑制人乳腺癌細胞增殖的作用[3]。但是格列美脲溶解性低，影響了其在體內的口服吸收；而包合材料β-環糊精(β-CD)的衍生物羥丙基-β-環糊精(HP-β-CD)熱穩定性強，水溶性好，對腎臟無毒性，對黏膜和肌肉幾乎沒有刺激性，溶血作用低，是目前最有前景的藥物載體材料之一[4]。因此，可以采用制劑手段，制備格列美脲包合物以提高藥物的溶解性并改善其生物利用度[5]。

為了易于操作便于工業化生產，本文采用GM與HP-β-CD通過研磨的方式進行包合，使兩者緊緊包合在一起，并通過Box-Behnken響應面法(Box-Behnken design response surface methodology, BBD-RSM)優化格列美脲HP-β-CD片的處方，以期得到最佳處方，且能為格列美脲片的進一步開發奠定良好的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器

GM對照品(批號：100674-201102，中國食品藥品檢定研究院)，GM原料藥(批號：140132-319334，武漢遠成共創科技有限公司)；乳糖Flow-100(Lactose Flow-100，德國Meggle公司)，微粉硅膠和羧甲基淀粉鈉(湖州展望藥業有限公司)，HP-β-環糊精(武漢諾梵生物科技有限公司)，微晶纖維素、聚維酮K30、硬脂酸鎂(安徽山河藥用輔料股份有限公司)，羥丙基甲基纖維素(上海卡樂康包衣技術有限公司)，其他輔料均為藥用級；甲醇、乙腈為色譜純，其他化學試劑均為分析純。

LC-10A高效液相色譜儀(含LC-10AT泵和SPD-10A檢測器，日本島津公司)；2000傅立葉紅外波譜儀(美國PerkinElmer公司)；BS224S型電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；SHZ-22水浴恒溫振蕩器(江蘇省太倉縣醫療器械廠)；TDP-5T型單沖壓片機(上海超億制藥機械設備有限公司)；CJY-2C型片劑脆碎硬度測定儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)；RC806D溶出試驗儀(天津市天大天發科技有限公司)。

1.2 方法學驗證

1.2.1 色譜條件

通過查閱GM有關文獻[6-7]及預實驗確定其色譜條件：Hypersil BDS-C18柱(200mm×4.6mm, 5μm)，流動相為乙腈：0.1%磷酸二氫鈉(60:40)，檢測波長為228nm，流速為1.0mL/min，進樣量為20μL，柱溫為室溫。

1.2.2 溶液的配制

對照品溶液：精密稱取GM對照品置于容量瓶中，加適量80%乙腈溶液，超聲溶解后，放冷，用80%乙腈稀釋定容至刻度，搖勻，即得400μg/mL GM對照品貯備液。

供試品溶液：精密稱取GM包合物片劑研磨粉置于容量瓶中，加適量80%乙腈溶液，超聲溶解后，放冷，用80%乙腈稀釋定容至刻度，搖勻，用0.45μm濾膜進行過濾，即得20μg/mL的供試品溶液。

1.2.3 標準曲線及線性范圍

精密吸取適量對照品貯備液，配制成0.1、0.5、1.0、5.0、10、20、40和80μg/mL對照品溶液，進樣測定，在波長228nm處用高效液相色譜儀測定其峰面積，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標進行線性回歸處理。

1.2.4 精密度

取濃度為20μg/mL的GM對照品溶液，在相同條件下，連續進樣6次，測定其峰面積，考察方法的精密度。

1.2.5 重復性

按“1.2.2”項下GM供試品溶液的配制方法，在相同條件下，平行制備6份樣品，測定其峰面積，考察方法的重復性。

1.2.6 穩定性

取濃度為20μg/mL的GM對照品溶液和20μg/mL的供試品溶液，在室溫條件下保存，分別于0、1、2、4和6h測定其峰面積，考察溶液的穩定性。

1.2.7 回收率

分別配制16、20和24μg/mL的GM對照品溶液，依次稱取處方量的輔料至9個25mL的容量瓶中，分別加入高、中、低濃度對照品溶液，每種濃度分別制備3份，按供試品制備方法操作，取續濾液進樣測量其峰面積，按對照品溶液峰面積計算GM的含量并求得其回收率。

1.3 處方制備

1.3.1 包合物的制備

參照文獻[8-10]先稱取原料藥和包合材料用研缽進行研磨包合，再稱取相關輔料，用等量遞加的方式進行研磨混勻，以保證本品含量均勻度符合規定。

1.3.2 GM普通片及環糊精包合物片劑的制備

普通片制備通過過篩方式先將處方量的API與乳糖采用等量遞加法過65目篩混合均勻，再依次加入其余輔料混合均勻，加入黏合劑制成軟材，過24目篩制粒，濕顆粒在50℃干燥40min，過24目篩整粒，加入潤滑劑混合均勻，調節裝量在200mg左右，調節硬度60N左右，壓片。GM包合物片劑制備采用研磨法先將處方量API與HP-β-CD加入研缽，充分研磨攪拌。然后根據等量遞加法加入其他輔料研磨攪拌均勻，加入黏合劑制成軟材，過24目篩制粒，濕顆粒在50℃干燥 40min，過24目篩整粒。取干顆粒加入潤滑劑，混合均勻，調節裝量在200mg左右，調節硬度60N左右，壓片(原輔料均已提前過80目篩)。

1.4 處方優化

1.4.1 處方單因素實驗

分別以不同的稀釋劑比例、黏合劑種類、黏合劑濃度、崩解劑比例和潤滑劑比例進行單因素實驗，通過測定其累積溶出度使用f2因子比較不同處方間的差異(50≤f2≤100時，認為兩條曲線相似或等同)。

1.4.2 響應面優化設計

通過單因素實驗結果，以溶出度為響應值，稀釋劑比例(A)、黏合劑濃度(B)和崩解劑比例(C)為因變量進行3因素3水平的BBD-RSM實驗優化(表1)。通過Design Expert 8.0.6.1軟件對數據進行結果分析，模型驗證得出GM環糊精包合物的最優條件。

表1 BBD選擇的變量編碼及其水平Tab. 1 Level and code of variables chosen for box-behnken design

1.5 GM包合物驗證

1.5.1 包合物的表征

用溴化鉀壓片法，對GM、HP-β-CD、GM/HP-β-CD物理混合物和GM/HP-β-CD包合物，分別在400～4000cm-1的波數范圍進行紅外吸收光譜測定。

1.5.2 溶解度的測定

稱取過量的GM，GM/HP-β-CD物理混合物，GM/HP-β-CD包合物樣品分別置于15mL試管中，加10mL水配成過飽和溶液，置于水浴恒溫搖床振搖[(25±0.5)℃，120r/min] 48h，用0.45μm的微孔濾膜迅速過濾，將濾液經流動相稀釋適當倍數后于228nm處由HPLC測定，代入標準曲線方程，經計算得到GM，GM/HP-β-CD物理混合物，GM/HP-β-CD包合物樣品在水中的溶解度。

1.6 片劑的質量檢查

按照中國藥典四部[11]的要求依次對片劑的片重差異、脆碎度、溶出度及含量均勻度進行檢查。

1.7 片劑的體外釋放

采用重蒸水、pH7.8的磷酸鹽緩沖液和0.02%的三羥基氨基甲烷為溶出介質，量取溶出介質900mL置于溶出杯內，待溶出介質溫度恒定在37.0℃后，取6片供試品分別投入6個溶出杯內，設置轉速75r/min，分別于5、15、30、60和90min時間點取樣適量并補充相同體積的同溫釋放介質，用0.45μm濾膜進行過濾，取續濾液進高效液相色譜儀進行含量分析，計算累積溶出度。

1.8 統計學方法

響應曲面模型的回歸方程式和顯著性統計用Design Expert 8.0.6.1 軟件進行計算和分析。單因素實驗結果采用直觀分析和方差分析，考察稀釋劑比例、黏合劑種類、黏合劑濃度、崩解劑比例和潤滑劑比例對其的影響。

2 結果與分析

2.1 HPLC法測定GC含量的方法學驗證

標準曲線的回歸方程為y=65248x+589.7(R2=0.9999,n=8)，線性范圍0.1～80μg/mL；精密度實驗RSD為0.86%(n=6)，重復性實驗RSD為1.02%(n=6)；穩定性實驗對照品與供試品RSD分別為0.96%和1.21%；低、中和高3種劑量平均回收率分別為98.85%、100.63%和99.74%，RSD分別為1.19%、0.48%和0.85%(n=3)。結果表明，建立的HPLC含量測定方法符合試驗測定要求。

2.2 單因素實驗結果與分析

2.2.1 稀釋劑比例的影響

使用初選處方輔料的稀釋劑-乳糖和MCC，控制裝量為200mg，按照2:1、5:1和8:1的比例配制處方，根據片劑的累積溶出度為考察指標進行篩選，結果見圖1a。

結果表明，乳糖和MCC的比例對片劑的體外釋放有顯著影響，f2(2:1、5:1)和f2(2:1、8:1)分別為35.44和43.57。乳糖為水溶性輔料，MCC為水不溶性輔料，乳糖比例越大理論上溶出越快，但由于親水性乳糖比例過大會導致片劑結合過于致密，反而會影響藥物前期和中期的釋放。

2.2.2 黏合劑種類的影響

使用初選處方輔料的黏合劑-淀粉漿、HPMC、PVP，考察其種類對片劑累積溶出度的影響，結果見圖1b。

結果表明，黏合劑種類對片劑的體外釋放有顯著影響，f2(淀粉漿，PVP)和f2(PVP、HPMC)分別為25.15和32.11。淀粉漿作為一種傳統使用的黏合劑，由于其糊化會導致藥物包裹在其中，造成后期藥物不易完全釋放，因此在目前藥物開發中使用的越來越少；HPMC由于在冷水中不易分散，而在熱水中溶解性又較差，因此配制過程先要在熱水中分散，隨后冷卻后再溶解，過程較為繁瑣且在此處方中效果不及PVP。綜合考慮，固化黏合劑為PVP。

2.2.3 黏合劑濃度的影響

通過篩選黏合劑種類，確定使用PVP為黏合劑，現進一步對其濃度進行篩選，現擬定5%、10%、15% 共3種濃度為比較對象，根據片劑的累積溶出度為考察指標進行篩選，結果見圖1c。

結果表明，黏合劑濃度對片劑的體外釋放有顯著影響，f2(5%、15%)和f2(10%f15%)分別為34.94和34.42。使用15%PVP其溶出度較其他兩種都低，且采用PVP 15%黏合劑制軟材，黏合劑溶解較慢，后期釋放較慢。而5%及10%的PVP總體差別不大，因此需進一步優化得出最佳處方。

2.2.4 崩解劑比例的影響

使用初選處方輔料的崩解劑-CMS-Na，考察其占處方總比例大小對片劑質量的影響。現擬定3種比例2.5%、5%和7.5%為比較對象，將片劑的累積溶出度作為考察指標進行篩選，結果見圖1d。

結果表明，在擬定3種比例7.5%、5%、2.5%中，使用2.5%的崩解劑其溶出速率較其他兩種都慢一點，f2(2.5%，5%)和f2(2.5%、7.5%)分別為39.60和37.50。隨著崩解劑比例提高至5%，片劑的溶出體現出明顯改善的趨勢，但比例繼續增大至7.5%，溶出的變化不是很明顯，因此需進一步優化得出最佳處方。

2.2.5 潤滑劑微粉硅膠的影響

使用初選處方輔料的潤滑劑-微粉硅膠，考察其添加對片劑質量的影響。根據片劑的累積溶出度為考察指標進行篩選，結果見下圖1e。

結果表明，微粉硅膠的比例對體外釋放無顯著影響，f2(0.5%、1%)和f2(1%、1.5%)分別為78.29和75.98。但考慮到添加微粉硅膠可以改善流動性且溶出度高，所壓片劑硬度適宜，崩解時限也相對較快等特點；綜合考慮固化微粉硅膠比例為1%。

2.3 響應面優化實驗

2.3.1 BBD-RSM 實驗設計結果

圖1 不同影響因素的釋放曲線Fig.1 Dissolution curves of different in fluencing factors

根據單因素實驗結果表明：稀釋劑比例(A)、黏合劑濃度(B)和崩解劑比例(C)是影響藥物釋放的主要因素，以其作為自變量，溶出度為響應值進行3因素3水平BBD-RSM實驗優化(表1)。保持各處方API 2mg，黏合劑采用PVP，潤滑劑占處方1%的量，用 Design-Expert 8.0.6進行實驗設計，共17組處方組成，制備包合物片劑并測定各處方在15min的溶出度，結果見表2。

表2 BBD試驗結果的實測值Tab. 2 Box-Behnken design matrix along with test values

2.3.2 響應面結果分析

經過模型擬合確定最優模型為二次多項式，模型具有顯著性，失擬項無顯著性，具有統計學意義。通過實驗得到的模型回歸方程為：Y=79.96+5.40A-4.60B+3.65C-3.55AB+2.00AC-3.80BC-5.51A2-3.06B2-2.60C2(R2=0.9483；模型：F=14.27，P=0.0010，有意義；失擬項：P=0.1636，無意義)。影響藥物溶出的主次因素是：稀釋劑比例(A)＞黏合劑濃度(B)＞崩解劑比例(C)，除了因素A、B和C外，A2、B2以及交互項AB和BC都是影響溶出度的顯著因素。包合物片劑溶出度的等高圖及響應面3D圖譜如圖2所示。從圖中可以看到，稀釋劑乳糖和微晶纖維素的比例對片劑溶出度的影響最大，隨著乳糖比例的提高，溶出度先急速增大，后又慢慢減小。其次，黏合劑濃度和崩解劑比例對溶出度也有較為顯著的影響，隨著黏合劑濃度提高，溶出度先緩慢增大然后顯著減小；隨著崩解劑比例增大，溶出度先升高后趨于平緩。通過直觀圖得出的結果與模型方程得到的結果一致，這也反映了模型方程的可靠。

2.3.3 優化條件的驗證試驗

采用 Design-Expert V8.0.6.1軟件對方程中Y求解，得到HP-β-CD格列美脲片的理論最佳條件為：稀釋劑-乳糖和MCC的比例為7.37:1，黏合劑-PVP的濃度為6%，崩解劑-CMS-NA的比例為6.45%。為了簡化實際操作的難度，HP-β-CD格列美脲片最佳條件修正為稀釋劑-乳糖和MCC 的比例為7.5:1，黏合劑-PVP的濃度為6%，崩解劑-CMS-NA的比例為6.5%。此條件下進行3組平行實驗，所得溶出度的平均值為88.13%(n=3)，而回歸方程所得的溶出度理論預測值為88.69%，兩者相對誤差為0.64%，說明運用響應面法優化得到的模型參數準確可靠。

2.4 包合物的驗證結果

2.4.1 紅外吸收光譜

由圖3所示，GM(a)在3369～3288cm-1為N-H拉伸振動的吸收峰(如3366和3291cm-1處的峰)，在1708～1673cm-1處為格列美脲分子內的羰基伸縮振動吸收峰(如1706和1673cm-1處的峰)，在1345～1153cm-1處為分子內磺酰胺基團的不對稱伸縮振動吸收峰(如1340和1153cm-1處的峰)；HP-β-CD(b)在3500～3300cm-1處為O-H拉伸振動峰(如3429cm-1處的峰)，在3000～2800cm-1處為CH-CH2的伸縮振動峰(如2934cm-1處的峰)；而HP-β-CD/GM物理混合物(c)的峰為a和b峰的簡單疊加，GM和HP-β-CD的特征吸收峰均沒有變化；HP-β-CD/GM包合物(d)的峰同a、b和c相比沒有太大變化，說明骨架結果并沒有發生變化，但在3369～3288cm-1處的峰明顯加寬，且HP-β-CD在3429cm-1處的峰在(d)藍移到了3348cm-1處，這是由于包合作用使GM的特征峰被HP-β-CD的峰減弱，同時HP-β-CD峰的環境改變導致振動頻率降低。在a上1708～1673cm-1和1345～1153cm-1處的峰在d上只可觀察到1345～1153cm-1處的峰，1708～1673cm-1處的峰在d上消失，這是因為形成包合物后，由于GM分子較大使得HP-β-CD只能部分包合還有一部分基團未被包合物包合進去，進一步說明確實形成了穩定的包合物。

2.4.2 水溶性測定

按溶解度的測定項下方法操作，經帶入標準曲線后得出實驗結果如表3所示。由表3可知，GM原料藥的溶解度僅為1.36μg/mL，GM/HP-β-CD物理混合物的溶解度提高了20多倍，而GM/HP-β-CD包合物在水中的溶解度提高了50多倍。事實證明，GM被水溶性極好的HP-β-CD包合后，水溶性得到了極大的改善。

圖2 影響因素對藥物溶出度影響的等高線圖與3D圖譜Fig.2 contour map and 3D map of in fluencing factors on dissolution of drugs

2.5 片劑的質量檢查結果

2.5.1 片重差異的檢查

取供試品20片，精密稱定總重量，求得平均片重后，再分別精密稱定每片的重量，每片重量與平均片重比較，計算重量差異，結果見表4。

2.5.2 脆碎度的檢查

取供試品32片洗耳球吹去粉末后稱得總重，100轉后洗耳球吹去粉末后再稱得總重，計算減失重量，結果見表4。

2.5.3 含量均勻度的檢查

取供試品1片置于50mL的容量瓶中，加1～2mL重蒸水，超聲使藥片崩解，加80%乙腈適量，使溶解后，定容搖勻，即得。用0.45μm的濾膜過濾后，取續濾液作為供試品溶液，進高效液相色譜儀分析其含量，結果見表4所示。

2.5.4 溶出度的檢查

取本品依照中國藥典(2015版)采用漿法測定GM片劑溶出，轉速為75r/min，900mL pH7.8磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer, PBS)為溶出介質，15min取溶液過0.45μm的濾膜后取續濾液用HPLC分析，考察溶出度，結果見表4。

圖3 GM(a)、HP-β-CD(b)、HP-β-CD/GM物理混合物(c)和HP-β-CD/GM包合物(d)紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of glimepiride (a), HP-β-CD (b), HP-β-CD/glimepiride physical mixture (c), HP-β-CD/glimepiride inclusion complex (d)

表3 樣品的水溶性測定結果(n=3)Tab. 3 Determination of water solubility of samples (n=3)

由表4可知，制備的GM普通片及環糊精包合物片劑在含量均勻度、片重差異、脆碎度和溶出度方面均滿足2015版藥典要求。

2.6 體外釋放曲線的繪制

采用重蒸水、pH7.8的磷酸鹽緩沖液和0.02%的三羥基氨基甲烷為溶出介質，分別取格列美脲片和優化后的HP-β-CD格列美脲片，按片劑的體外釋放項下方法進行含量測定，計算累積釋放度，結果見圖4。

由圖4分析可知，在PBS和三羥基氨基甲烷的釋放介質中，兩種格列美脲片釋放結果差異較小，90min時兩者均已達到85%以上，相對較為穩定；而在水中兩者的釋放結果相差較大，90min時格列美脲片才達到60%，而HP-β-CD格列美脲片的釋放已達93.28%，明顯優于格列美脲片。作為難溶性藥物，體外與體內釋放具有一定的相關性，提升其體外釋放意義重大；在0.02%的三羥基氨基甲烷溶液中，兩者區分力最小，而在水中區分力最大，因此可以選擇重蒸水作為篩選最優處方的釋放介質。

3 討論

HP-β-CD為水溶性材料，過大的溶解度導致使用飽和溶解度法不能很好地進行制備，而本文通過研磨法制備包合物具有操作簡便、成本低廉和易于工業化生產等特點。通過響應面法對HP-β-CD格列美脲片處方進行優化，得到的優化模型預測性較好，其圖形直觀，且相比正交設計在實驗條件尋優過程中，可以連續地對實驗的各個水平進行分析。基于這些優勢，響應面法將在今后的處方設計與優化過程中發揮越來越重要的作用。

表4 格列美脲片的質量檢查結果Tab. 4 Quality controlled results of glimepiride table(n=3)

圖4 處方在3種介質中的溶出曲線Fig.4 Dissolution curves of the prescription in three media

測定結果表明，HP-β-CD與GM形成的包合物成功地改善了溶解性，從而有望改善其生物利用度。在體外釋放試驗中，普通片和包合片劑在水溶液中的區分力較大而在其余兩種介質中區分力較小，這是因為GM在0.02%的三羥基氨基甲烷溶液中的溶解度大，其溶解速率較快；而在pH7.8的磷酸鹽緩沖液中，GM的溶解度仍是在水中的近30倍，加上兩種片劑均提高了其溶解度，因此普通片與包合片劑并無大的區別；同理，在中性及酸性環境中，由于溶解度小，GM很依賴于制劑技術的改善。此前，由于檢測條件的限制，規格較小的藥物都采用小杯法進行溶出度的檢測，但難溶性藥物采用常規溶出介質很難達到漏槽條件，因此格列美脲片不得不采用三羥基氨基甲烷溶液這種專有介質，但這是以犧牲區分力為代價的。隨著制劑技術的進步與HPLC的普及，微量的準確檢測變得可能，除中國藥典外，各國藥典標準均無小杯法，是否停止采用小杯法以便同國際接軌，值得商榷。本文的研究結果將為GM制劑的開發奠定良好的理論基礎。