輔助性T細胞22及其效應分子在肝細胞癌中的檢測及意義

郝猛，李觀華，施珍

(九江市第一人民醫院檢驗科，江西 九江332000)

輔助性T細胞 （Th細胞）是T細胞的一個亞群，能夠輔助T、B淋巴細胞參與機體的免疫應答，其作用是通過分泌細胞因子來實現的；參與炎癥反應、免疫應答、損傷修復、細胞增殖與分化等生理病理過程。Th22是新近發現的一類Th細胞，以僅分泌IL-22，而不分泌IL-17和干擾素-γ(IFN-γ)為特點。有研究表明，Th22細胞與自身免疫性疾病、感染性疾病等病程的免疫過程有關；最近研究證實，Th22細胞及其效應分子存在多種腫瘤組織中分布和表達[1]。原發性肝癌的病因機制仍未明確，目前認為其主要影響因素包括肝硬化、病毒性肝炎、遺傳因素、飲用水污染和黃曲霉毒素等，肝細胞癌（HCC）大多數以合并乙型肝炎病毒感染和肝硬化為特點，且一致認為乙肝病毒(HBV)長期慢性感染是誘導肝細胞癌的發生的主要因素。近年來，肝細胞癌的常規治療效果差，免疫治療成為肝細胞癌的研究熱點，研究發現，Th細胞在肝細胞癌的進展中起重要作用，因而研究肝細胞癌發生、發展過程中Th細胞及其效應分子水平變化可以為肝細胞癌的臨床治療提供理論依據和新的途徑，為肝細胞癌的防治提供幫助。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2016年8月-2017年11月九江市第一人民醫院消化內科住院臨床診斷肝細胞癌患者38例、慢性乙型肝炎患者45例和體檢科健康者26例外周血標本；患者診斷均符合2012年歐洲肝臟病協會修訂的《原發性肝細胞癌管理指南》[2]和2015年我國修訂的《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[3]。肝細胞癌組中男性22例，女性16例，平均年齡為50.92±11.21歲，包括乙型肝炎病毒陽性患者28例；慢性乙型肝炎組中男性26例，女性19例，平均年齡為49.32±12.81歲。另收集26名健康對照組的外周血，其中男性16例，女性10例，平均年齡為52.16±11.82歲。

1.2 檢測方法

1.2.1 儀器與試劑 購自美國BD公司的FACSCalibur流式細胞儀及購自BD公司的抗人CD4、γ-干擾素、IL-17和IL-22抗體的檢測試劑；Hyelone公司提供的完全培養基RPMI 1640；淋巴細胞刺激液[離子霉素和佛波酯(美國eBioscience公司)、布雷菲德菌素 A(美國 BD公司)]；γ-干擾素、IL-17和IL-22檢測的ELISA試劑盒分別購自美國Biosource公司、PeproTech公司和R&D公司以及由上海科華提供的ST360酶標儀；采用羅氏Cobas e601化學發光儀及原裝配套檢測試劑。

1.2.2 流式細胞術(FCM)檢測Thl、Th17和Th22細胞亞群比例 取500μl全血和500μl 1640培養基(含10%FBS)混勻，加入淋巴細胞刺激混合液3μl（含佛波酯、離子霉素和布雷菲德菌素A），37℃、5%的CO2培養箱中培養4h。取上述培養標本200μl，加入 CD4 抗體充分混勻，4℃避光 30min。加入500μl固定通透液，充分混勻，4℃避光，20min；1250r/min離心5min，棄上清液，加入紅細胞裂解液，混勻，室溫避光溫育10min。1250r/min離心5min，棄上清液加人700μl通透液充分混勻，4℃，避光，10min，1250r/min 離心 5min，棄上清液，加入γ-干擾素、IL-17和 IL-22抗體，充分混勻，4℃，避光，30min加入700μl通透液洗，采用FACSCalibur流式細胞儀進行上機檢測，應用Flow Jo7.6.1軟件進行分析。

1.2.3 γ-干擾素、IL-17、IL-22、AFP、CEA、CA199、CA125的檢測 γ-干擾素、IL-17和IL-22分別采用美國Biosource公司、PeproTech公司和R&D公司 ELISA 試劑盒檢測；AFP、CEA、CA199、CA125均采用羅氏Cobas e601化學發光儀及配套檢測試劑檢測。

1.3 統計學方法 運用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析，計量數據以均數±標準差（）表示。采用獨立t檢驗分析各組間差異，采用Spearman檢驗分析Th22細胞頻數與相關臨床項目的相互關系；P值＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Thl細胞、Th17細胞和Th22細胞在各組外周血中頻數分布比較 HCC組和CHB組患者Thl細胞頻數分別為15.61%±8.86%和17.91%±8.91%，均明顯低于健康對照組的21.95%±8.07%，差異均具有統計學意義（P值均＜0.05）；而HCC組與CHB組無統計學差異。HCC組Thl7細胞頻數為3.01%±1.29%，健康對照組為2.05±0.89%，兩組比較差異均具有統計學意義 （P＜0.05）；CHB組患者Thl7細胞頻數為2.21±1.03%，與健康對照組的比較差異無統計學意義(P＞0.05)；同時HCC組與CHB組比較有統計學差異(P＜0.05)。HCC組和CHB組患者Th22細胞頻數分別為 1.72%±0.82%和 1.36%±0.78%，較健康對照組的0.96%±0.51%明顯升高(P值均＜0.05)；HCC組與CHB組間差異具有統計學意義(P＜0.05)。 見圖 1。

圖 1 Thl、Th17 和 Th22 在各組外周血中的頻數分布

2.2 γ-干擾素、IL-17和IL-22在各組血漿中水平比較 γ-干擾素在HCC組、CHB組血漿水平為(19.16±8.68)pg/ml、(25.56±9.98)pg/ml， 比較差異具有統計學意義 （P＜0.05），且均高于健康對照組的(12.89±6.58)pg/ml，差異均具有統計學意義 （P值均＜0.05）。IL-17在HCC組、CHB組血漿水平分別為(69.91±32.01)pg/ml、(63.13±31.73)pg/ml，比較差異無統計學意義（P＞0.05），但均高于健康對照組的(48.97±23.69)pg/ml，差異均具有統計學意義（P 值均＜0.05）。IL-22在HCC組、CHB組血漿水平分別為(35.67±23.21)pg/ml、（24.06 土 12.99）pg/ml，比較具有統計學意義（P值＜0.05）；均高于健康對照組的（14.99 士 8.49）pg/ml，差異均具有統計學意義（P值均＜0.05）。 見表 1。

2.3 肝細胞癌組Th22細胞與Thl、Th17細胞亞群表達頻數的相關性 HCC患者外周血中Th22細胞頻數與 Thl7細胞頻數呈正相關 (r=0.639，P=0.013）。而Th22細胞頻數與Thl細胞頻數無明顯相關性(r=0.078，P=0.717)。 見圖 2。

表1 γ-干擾素、IL-17和IL-22在各組血漿中水平比較（)

表1 γ-干擾素、IL-17和IL-22在各組血漿中水平比較（)

注：與對照比較：*P＜0.05差異具有統計學意義；與CHB組比較：△P＞0.05，差異無統計學意義。

組別 例數（n）HCC組CHB組對照組38 45 26 γ-干擾素(pg/ml)19.16±8.68*25.56±9.98*12.89±6.58 IL-17(pg/ml) IL-22(pg/ml)69.91±32.01*△63.13±31.73 48.97±23.69△35.67±23.21*24.06土12.99*14.99士8.49

圖2 肝細胞癌（HCC）外周血中Th17頻數與Th22頻數表達的相關性

2.4 肝細胞癌組Th22細胞頻數與IL-22血漿水平、血漿腫瘤標志物相關分析 結果發現肝細胞癌組外周血Th22細胞頻數和IL-22血漿水平存在明顯正相關（r=0.338，P=0.023），而 Th22 細胞頻數與腫瘤標志物 AFP、CEA、CA199、CA125均無相關性（P＞0.05）。 見表 2。

表2 HCC組Th22細胞與血漿IL-22、血漿腫瘤標志物相關分析（n=38）

2.5 肝細胞癌組中HBV攜帶者與未攜帶者Th22頻數、IL-22水平比較 HBV攜帶肝細胞癌患者與HBV未攜帶肝細胞癌患者外周血Th22頻數水平比較差異具有統計學意義（r=0.602，P=0.025）；HBV攜帶肝細胞癌患者與HBV未攜帶肝細胞癌患者外周血IL-22水平比較差異具有統計學意義 （r=0.574，P=0.038）。

3 討論

Th22細胞是學者們最近發現的CD4+T細胞功能亞群，其表達 CCR6、CCR4和 CCRl0，是僅以產生IL-22為主，但是不產生IFN、IL-4和IL-17，是獨立于Thl、Th2和Th17的一類細胞亞群。Th22細胞由Duhen等[4]和 Trifari等[5]最早于2009年發現的，是一類與皮膚免疫功能存在密切關系的CD4+T細胞功能亞群，其功能主要是通過IL-22發揮作用。IL-22屬于IL-10細胞因子家族，主要由Th22細胞和Thl7細胞亞群產生，其中Th22細胞分泌量可占總IL-22分泌量的65%左右；IL-22介導其影響通過異源二聚體跨膜受體復合物組成IL-22R1和IL-10R2，隨后激活Janus激酶信號轉導子和轉錄激活子（JAK-STAT）信號通路，包括STAT3的JAK1和TYK2[6]。STAT3磷酸化、下游基因Bcl-2和Bcl-XL上調、細胞周期蛋白D1和血管內皮生長因子(VEGF)均促進腫瘤的生長和轉移[7]。STAT3介導的T細胞擴張和Thl7細胞的增殖是促進腫瘤生長的關鍵[8]。在肝臟STAT3被激活后會誘導抗菌蛋白因子、急性時相因子、凋亡抑制因子和增值相關因子等的表達，因此我們都認為IL-22有表現為保護肝臟、促進肝細胞有絲分裂、甚至是促進腫瘤形成等作用[9-11]。IL-22的作用受體廣泛分布于皮膚、肝臟、腎臟、呼吸道及消化道等組織細胞中，主要是通過對組織細胞的作用來參與這些系統疾病的病理發生過程[12]。IL-22在皮膚的防御中發揮著重要的作用，并且在病毒和真菌感染中也起著相應作用；除感染性疾病外，IL-22在自身免疫性疾病，如銀屑病、Crohn'S疾病、潰瘍性結腸炎、類風濕性關節炎等疾病中表達水平均有所上調。Jiang等的研究顯示，肝癌微環境中高表達的IL-22會促進腫瘤的生長，抑制細胞凋亡，促進腫瘤轉移通過STAT3的活化[13]。康瑜[14]等研究表明在慢性肝病和肝硬化患者中Th22細胞血漿表達水平明顯增高，提示Th22細胞及效應分子參與了慢性肝炎肝硬化的發生發展過程，進一步推測肝細胞癌和慢性肝病發生的T細胞介導中與Th22細胞的免疫效應可能相關。在我們的實驗中也發現肝細胞癌組、慢性乙型肝炎組中外周血Th22頻數和IL-22血漿水平均顯著高于健康對照組，更重要的是，我們還觀察到血清IL-22水平與HCC患者中Th22細胞頻數相關，我們由此推測，Th22細胞通過產生IL-22促進肝細胞癌的發病機制。

目前Th22細胞在肝癌中的研究還不多見，僅有許秀華[15]等研究認為Th22細胞與Th1、Th17和Treg細胞一樣均參與了原發性肝癌的發病進展，外周血Th22細胞頻數表達與肝腫瘤直徑呈正相關。但Th22細胞與IL-22在其他腫瘤中的研究有相關報道，Sun等[16]的研究認為在直腸癌中Th22細胞可通過影響STAT3信號通路而控制結腸腫瘤的增長速度，促進腫瘤的生長；雷波等[17]的研究認為Th22細胞和IL-22在卵巢癌組織呈高水平表達，且與腫瘤分期呈正相關；另外Th22細胞及其效應分子在肺癌、宮頸癌、胰腺癌中的作用也有相關的報道。

有研究已證實HCC發病及進展中也存在其他CD4+T細胞亞群或相關細胞因子失衡。Thl細胞主要發揮抑制腫瘤的作用，HCC患者早期癌組織與外周血Th1細胞頻數表達明顯升高，而中晚期出現下降。本研究發現HCC外周血Th1細胞頻數均低于健康對照者和CHB組，主要考慮是因為HCC患者病例以晚期占多數。此外，我們還發現，肝細胞癌患者Th17細胞頻率也明顯高于健康對照組，且HCC患者外周血中Th22細胞與Thl7細胞頻數呈正相關 (r=0.639，P=0.013），提示Th22細胞與Th17細胞在肝細胞癌的發病機制中的有協同效應，但其協同效應仍不清楚，需要進一步研究。有試驗者將猿人類免疫缺陷病毒 （SHIV）感染獼猴后，發現在SHIV慢性感染后再次感染瘧疾時Th22細胞的表達水平較SHIV與瘧疾共同感染時高出200多倍，并與其預后明顯有關[18]，由此推測Th22表達水平與病毒感染存在一定的相關性；與本研究中CHB組Th22細胞頻數明顯高于健康對照組，HBV攜帶肝細胞癌患者Th22細胞頻數明顯高于HBV未攜帶肝細胞癌患者相一致。雖然Th22細胞有促進再生的作用，但我們實驗并未發現與診斷HCC再生的經典指標—AFP有明顯相關性，這可能與兩者刺激分泌的路徑不同有關。

Th22細胞及其效應分子參與了肝細胞癌的發病發展過程，為肝細胞癌的發病機制提供新的線索，未來更多的研究探討Th22細胞與肝內微環境間的相關作用，為促進輔助性T細胞亞群及相關因子在肝細胞癌中的免疫治療發展提供依據。