瑞芬太尼改善異氟醚致新生大鼠神經(jīng)毒性的機制

(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院麻醉科 上海 200090)

臨床上,由于各種疾病的影響,孕產(chǎn)婦和嬰幼兒常常需要接受全身麻醉。常用的全麻藥容易透過胎盤進入胎兒體內(nèi),由于胎兒或者嬰幼兒的大腦發(fā)育不完善,麻醉藥極易通過血腦屏障對發(fā)育大腦產(chǎn)生影響[1]。目前,大量基礎(chǔ)研究表明,全麻藥無論是吸入麻醉藥還是靜脈麻醉藥,均會損傷發(fā)育中的大腦,表現(xiàn)在多個腦區(qū)[2-3]或同一腦區(qū)的不同類型細胞[4],并且這種幼年時期由麻醉藥所致的神經(jīng)毒性會延續(xù)到成年,表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶等行為的改變[5-6]。2017年美國FDA發(fā)出警告,稱反復(fù)或長時間暴露于麻醉藥或鎮(zhèn)痛藥會損傷胎兒及3歲以下兒童的大腦發(fā)育[7]。盡管目前還沒有高質(zhì)量的臨床研究支持這一結(jié)論,但這一問題已引起廣泛關(guān)注,改善麻醉藥對發(fā)育大腦的影響也成為研究的熱點。

神經(jīng)炎癥被認為是全麻藥神經(jīng)毒性機制之一。異氟醚可使細胞膜、線粒體膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣通道發(fā)生改變,增加細胞內(nèi)鈣離子濃度。鈣離子濃度的增加導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)的NF-κB活化,進入細胞核識別目的基因,促進炎癥因子的進一步轉(zhuǎn)錄[8-9]。適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)對機體修復(fù)是有利的,過度的炎癥反應(yīng)就會對機體造成損傷。瑞芬太尼作為一種短效的阿片受體激動藥,因其獨特的藥代動力學(xué)特性廣泛應(yīng)用于臨床,近年來在嬰幼兒中的應(yīng)用也逐漸增多[10]。有研究發(fā)現(xiàn)瑞芬太尼可改善由脂蛋白引起的中性粒細胞激活[11],并且在肝損傷[12]及肺缺血再灌注損傷[13]等模型中發(fā)現(xiàn)有抑制外周炎癥的作用。因此,我們用切口痛模型模擬臨床手術(shù)操作,探究在創(chuàng)傷刺激條件下,瑞芬太尼能否改善新生大鼠多次異氟醚暴露引起的神經(jīng)毒性。

材 料 和 方 法

Westernblot檢測各組幼鼠在第3天麻醉結(jié)束后6 h取材。各組幼鼠直接斷頭在冰上迅速分離海馬組織。將雙側(cè)海馬組織放入清潔的EP管中,加入300 μL 4 mmol/L HEPS (40 mmol/L HEPS 5 mL+5.48 g葡萄糖+1片cocktail 溶于50 mL蒸餾水中),冰浴上用勻漿器低速勻漿,至液體渾濁組織完全裂解;置于4 ℃離心機(1 000g×10 min),取出上清即為胞質(zhì)蛋白,沉淀為膜蛋白;在沉淀里加入150 μL裂解液后超聲震蕩即可進行后續(xù)操作,或儲存于-80 ℃冰箱。用BCA法測量蛋白濃度。將計算好的樣品與1×加樣緩沖液混勻后,在100 ℃金屬浴中加熱5 min,然后放到冰上冷卻。配制12%的分離膠及5%的濃縮膠,每孔加30 μL配制好的樣品,濃縮膠的電壓為60 V,恒流,待溴酚藍跑成一條直線將電壓調(diào)至100 V,直至到達距離玻璃板下緣0.5 cm處,關(guān)掉電源。在冰浴中,100 V恒流電壓90 min條件下轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。將PVDF膜放入用含1%脫脂牛奶的TBST稀釋的NF-κB p65抗體(美國CST公司,9 661 s,1∶1 000)與GAPDH抗體(美國Bioworld公司,1∶1 000),β-actin抗體(美國Abcam公司,1∶1 000)搖床室溫1 h,然后置于4 ℃搖床過夜。TBST洗膜4次,每次15 min。將PVDF膜放入含1%脫脂牛奶的TBST稀釋的HRP偶聯(lián)的二抗室溫1 h,洗膜后化學(xué)發(fā)光。用Image J 1.50軟件進行分析條帶。

q-RT-PCR檢測將左側(cè)的海馬組織加入0.5 mL Trizol中,用電動勻漿器充分勻漿,然后再加入0.5 mL Trizol,室溫下充分裂解5 min,使核蛋白完全解離;向1中200 μL三氯甲烷,劇烈震蕩1s,靜止3 min;4 ℃下10 000×g離心15 min,取上清。加入等體積的異丙醇,顛倒混勻,室溫放置10 min;4 ℃下10 000×g離心10 min,除去上清液。加入DEPC配制的75%乙醇1 mL,充分洗滌管壁和管蓋,輕彈管底讓沉淀懸浮起來;4 ℃下10 000×g離心3 min,棄上清,超凈臺中晾干;加入20 mL DEPC溶解沉淀。對提取的RNA進行定量與定性分析,隨后進行逆轉(zhuǎn)錄。

免疫熒光腹腔注射水合氯醛0.3 mL/kg麻醉,固定四肢,暴露胸腔,將頭皮針置入左心室,剪開右心耳,灌注生理鹽水50 mL后繼續(xù)灌注4%多聚甲醛50 mL。取出大腦,用4%多聚甲醛固定24 h,再分別用20%及30%蔗糖溶液進行梯度脫水。用OCT包埋后置于橫冷冰凍切片機內(nèi)。做冠狀切片(30 μm)并收集在24孔板內(nèi),置于原位雜交保護液中-20 ℃保存。清洗腦片:PBS 10 min×2次,0.3% PBST 10 min×2次;破胞膜:1% PBST 15 min,0.3% PBST 5 min×2次;封閉:10%羊血清封閉1 h;一抗孵育:1%羊血清與IBA1一抗(美國Wako公司,1∶2 000)渦旋震蕩混勻后室溫孵育1 h,置于4 ℃搖床過夜;復(fù)溫:37 ℃溫箱30 min,0.3%PBST 5 min×3次;二抗孵育:1%羊血清與二抗(美國Sigma公司,1∶1 000)渦旋震蕩混勻后室溫避光孵育1 h,0.3% PBST 5 min×3次;貼片,封片后置于熒光顯微鏡下觀察。

被動回避實驗被動回避實驗是經(jīng)典的檢測學(xué)習(xí)與記憶的行為學(xué)測試,我們在大鼠出生后第65和66天進行被動回避實驗。實驗設(shè)備由明箱(20.3 cm×15.9 cm×21.3 cm)和暗箱(20.3 cm×15.9 cm×21.3 cm)構(gòu)成,中間由自動門將明箱與暗箱分隔開。被動回避實驗由兩部分構(gòu)成,一部分是電刺激訓(xùn)練階段,另一部分是潛伏期測試階段。訓(xùn)練階段是將大鼠從明箱的一側(cè)放入,10 s后電動門自動打開,大鼠進入暗箱,自動門1 min后關(guān)閉,給予大鼠0.5 mA電刺激3 s,3 min后取出大鼠。第2天進行潛伏期測試,記錄大鼠由明箱進入暗箱的時間。如果大鼠3 min后未進入暗箱,記作“無反應(yīng)”。每只大鼠測試完畢后,清理排泄物并用酒精擦拭,避免氣味對后續(xù)大鼠造成影響。

結(jié) 果

海馬內(nèi)炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA的相對表達量變化與Sham組相比,Iso組與Iso+I組IL-1β與TNF-α的mRNA顯著增加,但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (IL-1β:3.27±0.63vs.3.32±0.32,P=1.00;TNF-α:3.18±0.64vs.2.90±0.48,P=1.00),IL-6在各組間表達無明顯變化(Shamvs.Iso:1.00±0.00vs.2.11±0.56,P=1.00;Shamvs.Iso+I:1.00±0.00vs.3.20±1.15,P=0.367)。然而,瑞芬太尼顯著下調(diào)IL-1β和TNF-α的mRNA 水平(IL-1β:1.68±0.21vs.3.32±0.42,P=0.047;TNF-α:1.15±0.20vs.2.90±0.48,P=0.043),詳見圖1。

圖1海馬炎癥因子的mRNA相對表達量
Fig1mRNArelativeexpressionofhippocampalinflammatorycytokines

海馬內(nèi)NF-κBp65蛋白入核比例變化Western blot結(jié)果顯示(圖2),Iso+I組海馬內(nèi)胞核和胞質(zhì)的NF-κB p65比值較Sham組明顯升高(1.00±0.00vs.1.75±0.21,P=0.003),說明NF-κB p65入核較多。瑞芬太尼能下調(diào)NF-κB p65入核量(1.75±0.21vs. 1.19±0.07,P=0.039)。

圖2NF-κBp65蛋白入核比例變化
Fig2RatioofnuclearandcytosolicNF-κBp65protein

海馬CA1、CA3和DG區(qū)IBA1陽性細胞數(shù)變化在海馬CA1、CA3和DG區(qū),Iso+I組較Sham組出現(xiàn)較多的IBA1陽性細胞 (CA1:54.73±4.79vs.95.64±5.02,P<0.005;CA3:36.20±4.25vs. 67.91±5.51,P<0.001;DG:32.00±4.26vs.62.55±5.04,P<0.001)。Iso+I組與Ref組相比,瑞芬太尼在CA1和CA3顯著減少由異氟醚所致的IBA1數(shù)量的增加(CA1:95.64±5.02vs.70.49±3.84,P=0.008;CA3:67.91±5.51vs.47.99±4.29,P=0.019),而在DG區(qū)兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

圖3海馬CA1、CA3和DG區(qū)IBA1陽性細胞數(shù)變化
Fig3ChangeofIBA1positivecellsnumberinhippocampalCA1,CA3andDGarea

被動回避實驗與Sham組相比,Iso+I組潛伏期(s)明顯縮短(96.50±20.24vs.30.22±8.97,P=0.03)。在創(chuàng)傷條件下,與Ref組相比,Iso+I組瑞芬太尼能改善異氟醚所致的潛伏期(s)縮短(118.18±20.74vs.30.22±8.97,P=0.03)。Iso組與Iso+I組之間潛伏期(s)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(31.93±11.00vs.30.22±8.97,P=1.00),詳見圖4。

討 論

在體外實驗中,瑞芬太尼被發(fā)現(xiàn)可以通過阿片受體和N-甲基-D-天冬氨酸(N-mcthyl-D-aspartic acid,NMDA)受體對發(fā)育中的大腦發(fā)揮抗凋亡的作用[15],在我們之前的實驗中也發(fā)現(xiàn)瑞芬太尼對新生鼠暴露4 h的異氟醚產(chǎn)生的神經(jīng)毒性有抗凋亡的作用[16]。但瑞芬太尼改善異氟醚所致神經(jīng)毒性的機制仍不明確。

圖4被動回避實驗的潛伏期變化
Fig4Latencyofpassiveavoidancetest

出生7天的大鼠相當(dāng)于人類的2～3歲,此階段又稱“腦發(fā)育關(guān)鍵期”。在成熟大腦中,麻醉藥與鎮(zhèn)痛藥被認為是具有抗炎作用[17],而對發(fā)育中的大腦可能產(chǎn)生促炎作用[18]。γ-氨基丁酸(γ-amino-butyric acid,GABA)受體在發(fā)育期被激活后產(chǎn)生神經(jīng)興奮作用,到成年后轉(zhuǎn)變?yōu)橐种茽顟B(tài),由此可能導(dǎo)致從促炎狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐盅谞顟B(tài)[19]。還有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元的凋亡釋放炎癥因子,這些炎癥因子激活小膠質(zhì)細胞,促使小膠質(zhì)細胞進一步分泌炎癥因子,這種惡性循環(huán)促使產(chǎn)生炎癥瀑布反應(yīng)[20]。我們的研究中發(fā)現(xiàn)多次暴露異氟醚可造成新生大鼠大腦神經(jīng)炎癥反應(yīng),表現(xiàn)為海馬炎癥因子的mRNA及蛋白表達水平增加,小膠質(zhì)細胞活化,并且這種神經(jīng)損傷引起的后果會持續(xù)到成年,瑞芬太尼復(fù)合異氟醚應(yīng)用后能改善異氟醚所致的神經(jīng)炎癥與學(xué)習(xí)記憶障礙。

與以往基礎(chǔ)實驗不同的是,我們選擇了切口痛模型模擬臨床的手術(shù)刺激,切口痛模型被認為是向臨床轉(zhuǎn)化的一個較為合理的模型[21]。手術(shù)本身可能會引起炎癥反應(yīng)[22]。Shu等[23]發(fā)現(xiàn)P7大鼠暴露于70%一氧化氮與0.75%的異氟醚6 h后,切口痛刺激都會導(dǎo)致皮層和脊髓神經(jīng)元凋亡及炎癥因子表達增加,并通過條件恐懼實驗發(fā)現(xiàn)影響了成年后的認知功能。但我們的實驗中單純異氟醚組與異氟醚加手術(shù)組相比,海馬炎癥因子與小膠質(zhì)細胞數(shù)量變化在兩組中并無差異,說明神經(jīng)炎癥和學(xué)習(xí)記憶損害更可能是暴露異氟醚而非手術(shù)刺激引起,而瑞芬太尼改善的是異氟醚引起的神經(jīng)炎癥反應(yīng),與切口痛關(guān)系可能并不大或者我們選擇的這個切口痛模型不足以引起明顯的中樞炎癥。另外,我們在切開腳掌前用丁卡因明膠作表面麻醉,這也會減輕疼痛刺激從而可能會減輕或抑制切口痛的炎癥反應(yīng)。

小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞特異性蛋白抗體 IBA1在巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞中表達,并在這些細胞的活化過程中表達升高。在正常情況下,小膠質(zhì)細胞處于一種“靜息”狀態(tài),當(dāng)被某些病理或者生理條件激活后,在形態(tài)及數(shù)量上會發(fā)生明顯變化。活化后的小膠質(zhì)細胞會產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)及細胞因子,而這些炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α被認為參與了中樞炎癥反應(yīng)。當(dāng)一些外界因素如感染、病毒等入侵時可通過多種信號途徑激活NF-κB p65通路,活化的NF-κB轉(zhuǎn)入到核內(nèi)與相關(guān)的DNA基序結(jié)合誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄,進而促進炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α等的釋放。施慶余[24]發(fā)現(xiàn)新生大鼠暴露于1.5%異氟烷2 h后,海馬 IL-1β和TNF-α 的mRNA 表達上調(diào),分別在麻醉 4 h和 6 h時達峰值,并在麻醉停止12 h和24 h后恢復(fù)至正常水平;暴露于1.5%異氟烷4～6 h時,海馬 IL-6 的mRNA 表達上調(diào),在麻醉停止后恢復(fù)至正常水平。在我們的實驗中,麻醉結(jié)束后6 h,海馬內(nèi)炎癥因子IL-1β與TNF-α mRNA 的表達顯著增加,但IL-6 mRNA 的表達在各組中沒有變化,可能與炎癥因子在腦損傷后表達出現(xiàn)的峰值時間有關(guān)。

本實驗不足之處在于,新生鼠太小而無法進行插管,也無法記錄生命體征相關(guān)指標,但我們通過觀察麻醉過程中皮膚黏膜顏色變化及呼吸頻率的變化,判斷有無呼吸抑制現(xiàn)象。我們發(fā)現(xiàn)1.8%的異氟醚及瑞芬太尼無論是單獨使用還是聯(lián)合使用均不會造成明顯呼吸抑制。

綜上所述,在創(chuàng)傷刺激條件,瑞芬太尼改善異氟醚多次暴露所致新生鼠海馬神經(jīng)炎癥可能通過NF-κB p65通路發(fā)揮作用。