T-SPOT.TB檢測白塞病(BD)患者潛伏結核感染(LTBI)的臨床意義及隨訪觀察

(復旦大學附屬華東醫院免疫風濕科-上海市老年醫學臨床重點實驗室 上海 200040)

白塞病(Behcet’s disease,BD)是一種以血管炎為病理基礎的慢性多系統疾病,臨床上以復發性口腔潰瘍、外陰潰瘍和皮膚損害為基本特征,并可累及眼、消化道、心臟、血管、神經、關節和血液等多個系統,中國是BD高發國家之一[1]。BD臨床表現多樣,尚缺乏特異的實驗室指標,致病機制至今未明。環境因素特別是微生物感染如口腔厭氧菌、皰疹病毒以及結核分枝桿菌等可能與BD發病有關[2]。部分符合BD診斷標準的患者在使用激素或者免疫抑制劑治療后出現活動性結核,也有部分結核性淋巴管炎的患者臨床表現與BD類似,稱之為結核反應樣BD綜合征。臨床醫師在診斷BD和使用免疫抑制劑及激素前對結核進行篩查具有一定的臨床意義。

潛伏結核感染(latent tuberculosis infection,LTBI)定義為細菌活性持續存在,受到免疫控制且無活動性結核病臨床證據的狀態。如果不進行預防性藥物治療,LTBI者中5%～10%會發展成活動性結核病,而在有免疫異常基礎的患者中這一比例更高[3]。目前尚無診斷LTBI的金標準,結核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test,TST)既往被認為是重要且常用的檢測方法,但在接種卡介苗的地區,其特異性差,假陽性率較高,且容易與環境中非結核分枝桿菌產生交叉反應,在免疫缺陷患者中敏感性較差[4]。連續的結核分枝桿菌特異性T細胞檢測(T-SPOT.TB)作為一種γ干擾素釋放實驗(interferon-γ release assay,IGRA),是基于抗原特異性細胞免疫應答反應的免疫檢測技術,具有較高的特異性且不受卡介苗或者其他非結核分枝桿菌的影響。本研究對BD患者進行T-SPOT.TB檢測,分析其與臨床的相關性及在隨訪中的應用價值。

資 料 和 方 法

病例來源收集復旦大學附屬華東醫院免疫風濕科2012年10月至2017年6月住院的BD患者共計231例,排除以下患者:活動性結核1例;活動性淋巴結結核2例;T-SPOT.TB檢測結果不確定患者3例;確診的結核病患者,確診要求:痰涂片或培養出抗酸桿菌或病理找到抗酸桿菌,或根據臨床表現(如咳嗽、咳痰伴有午后低熱、盜汗等癥狀)、影像學(如肺結核多發生在肺上葉尖后段、肺下葉背段、后基底段或出現明顯空洞/結核球等)診斷的結核病。最終入組BD患者225例,所有患者診斷均符合1990年國際BD工作小組診斷標準[5],且所有患者均為活動期,活動指標評估采用國際BD學會(International Society for Beh?et’s Disease,ISBD)疾病活動量表(0～20分),≥7分為活動性患者。本研究得到復旦大學附屬華東醫院倫理委員會批準,入選者均簽署知情同意書。

T-SPOT.TB檢測結核感染T細胞檢測試劑盒購自上海復星長征醫學科學有限公司。肝素抗凝血8 mL,室溫放置不超過4 h。Ficoll淋巴細胞分離液密度梯度離心得到外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),計數活淋巴細胞。取出T-SPOT.TB試劑盒微孔板,1份標本需4個微孔板,陰性對照加入50 μL AIM-V培養液,陽性對照加入植物血凝素,另外2個孔分別加入抗原A(ESTA-6)和抗原B(CFP-10)各50 μL,然后每孔再分別加入100 μL PBMC。37 ℃、5% CO2培養箱孵育16～20 h后加酶標一抗,2～8 ℃孵育1 h,加顯色液50 μL,避光室溫反應7 min終止反應,室溫2 h干燥計數斑點數。陽性標準:空白對照孔斑點數0～5個時,抗原A或抗原B孔斑點數-空白對照孔斑點數≥6;空白對照孔斑點數6～10個時,抗原A或抗原B孔斑點數≥2×空白對照孔斑點數。若陰性對照孔斑點數超過10或陽性對照孔斑點數低于20時,結果不能確定。

隨訪對T-SPOT.TB檢測結果為陽性的66例BD患者,應用激素或免疫抑制劑前均給予預防性抗結核治療(異煙肼+利福平4個月或異煙肼/利福平單藥6個月)并每3個月隨訪1次,隨訪的中位時間為27.9(3～58)個月。隨訪內容包括:BD疾病的活動度及轉歸,實驗室檢查如血常規、肝腎功能、紅細胞沉降率、C反應蛋白;如患者出現發熱、咳嗽、咳痰或難以用BD疾病本身解釋的癥狀可進一步行痰培養、胸部X線/CT及胃腸鏡等檢查。

結 果

臨床資料本研究共納入BD患者225例,男性119例,女性106例,平均年齡(38.5±12.7)歲,平均病程(8.4±8.1)年。患者臨床表現中口腔潰瘍最為常見(98.2%),其他依次為生殖器潰瘍(74.2%)、皮膚損害(56.9%)、關節炎(29.8%)、眼部損害(18.2%)、胃腸道潰瘍(16.4%)、血管損害(4.4%)、中樞神經系統累及(2.7%)和附睪炎(2.2%)。

T-SPOT.TB篩查結果及分組比較根據T-SPOT.TB檢測結果分為LTBI組和非LTBI組,兩組在性別、年齡及病程上的差異均無統計學意義(表1);LTBI組患者口腔潰瘍發生頻率、每次發作的數量及潰瘍大小均明顯高于非LTBI組(P值分別為0.008、<0.001和0.001);LTBI組生殖器潰瘍和眼部損害發生率明顯高于非LTBI組(P值分別為<0.001和0.001)。兩組其他臨床表現(如結節性紅斑、假性毛囊炎、胃腸道潰瘍、關節炎、神經系統和血管損害)比較,差異無統計學意義。實驗室檢查:兩組在外周血WBC、Hb、PLT、ESR、CRP和免疫球蛋白水平上的差異均無統計學意義(表1)。

T-SPOT.TB檢測后BD患者治療及隨訪T-SPOT.TB陽性BD患者均給予預防性抗結核治療(異煙肼+利福平4個月或異煙肼/利福平單藥6個月)。在藥物治療過程中嚴密監測患者的肝功能,一旦出現肝炎臨床表現,立即停藥。66例LTBI陽性BD患者隨訪的中位時間為27.9個月,其中1例出現肝功能異常,停用抗結核藥物治療。所有患者均未發生活動性結核感染。其中9例LTBI的BD患者預防性抗結核治療后復查T-SPOT.TB,只有2例患者轉為陰性,余仍為陽性;另外,非LTBI組有1例BD患者在半年后復查T-SPOT.TB,結果仍為陰性(表2)。

討 論

LTBI感染是活動性結核病的重要來源,但目前尚無LTBI診斷金標準。目前國際上主要將TST和/或IGRA陽性且無結核病臨床癥狀和影像學陽性結果者視為LTBI患者。BD作為一種自身免疫性疾病,感染因素在發病機制中發揮一定的作用,且患者需要免疫抑制劑的治療,更增加了結核感染的風險。BD合并結核感染包括結核變態反應樣BD綜合征和BD并發結核感染,本研究排除以上兩種情況。

本研究首次在大樣本BD患者中使用T-SPOT.TB檢測外周血,結果發現LTBI陽性率達到29.3%。據WHO估計,全球約有1/3的人口是LTBI感染者。我國最新的數據顯示LTBI感染率為13%～20%[6],在風濕性疾病患者中的感染率為30%[7]。TST是診斷LTBI的傳統方法,但影響因素很多,敏感性和特異性偏低。T-SPOT.TB是IGRA的一種,體內曾受到結核桿菌抗原刺激形成致敏的T淋巴細胞再次遇到同類抗原ESTA-6和CFP-10時產生γ干擾素,通過檢測γ干擾素反映釋放γ干擾素的T淋巴細胞數目,具有較高的特異性且不受卡介苗或者其他非結核分枝桿菌的影響。最近一項關于風濕性疾病的Meta分析顯示IGRA對于LTBI診斷明顯優于TST[8]。

ItemLTBI group (n=66) Non-LTBI group (n=159) t or χ2PAge (y) 38.7±12.535.3±12.31.8900.060Sex (male:female)1.36∶11.06∶10.6750.411Disease duration (1 mo) 7.6±6.38.2±7.3-0.5800.563Oral ulcer Frequency (y)19.5±13.314.2±11.4102.0590.008 Number4.0±1.53.0±1.14.422<0.001 Scope3.7±0.93.3±0.93.3010.001Genital ulcer61 (92.4)106 (66.7)16.173<0.001Erythema nodosum36 (54.5)72 (45.3)1.6030.205Pseudofolliculitis barbae23 (34.8)46 (28.9)0.7680.381Gastrointestinal ulcers15 (22.7)22 (13.8)2.6830.101Eye involvement21 (31.8)20 (12.6)11.5850.001Arthritis21 (31.8)45 (28.3)0.2780.598Vascular involvement3 (4.5)7 (4.4)0.0021.000CNS involvement2 (3.0)4 (2.5)0.0481.000Leukocyte (×109)7.5±2.56.9±2.50.3610.246Hemoglobin (g/L)131±17136±66-0.6920.490 Blood platelet (×109)226±65243±74-1.5560.121Erythrocyte sedimentation rate (mm/h)27±2529±26-1.6900.672C-reactive protein (mg/L)14.8±12.5 14.7±12.60.2940.769 Immunoglobulin G (g/L)11.11±3.610.86±4.1-0.2600.761Immunoglobulin A (g/L)2.42±1.22.74±1.2-0.6450.302Immunoglobulin M (g/L)1.32±0.61.37±1.10.0680.839Immunoglobulin E (IU/mL)64.1±33.664.1±40.91.5690.121

BD:Behcet’s Disease;LTBI:Latent tuberculosis infection;CNS:Central nervous system.

表2 10例BD患者的T-SPOT.TB隨訪結果Tab 2 T-SPOT.TB results in the following up of 10 BD patients

I:Isoniazid;R:Rifampicin;N:No anti-tuberculosis medication.(1)Spot count.

我們在臨床研究中發現,LTBI組口腔潰瘍的嚴重程度明顯增高,生殖器潰瘍、眼部損害的發生率明顯高于非LTBI組,說明LTBI在BD疾病的發生發展過程中發揮一定的作用。既往研究提出假設:由熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)或者其他微生物片段引起的抗原驅動的免疫反應在BD中起到重要作用[9]。Pervin等[10]研究發現,BD患者T細胞抗原表位的HSP是通過刺激來源于結核分枝桿菌HSP的T細胞重疊合成肽,從而引起免疫交叉反應導致BD的發生發展。具體的致病機制還有待進一步的研究。

在隨訪中,我們對10例BD患者再次行T-SPOT.TB檢測發現有2例(20%)患者轉為陰性,高于文獻報道數據(4.5%～12.1%)[11-12]。這可能與本研究的病例數較少或者所研究的疾病及人種不同有關。BD治療過程中會使用到免疫抑制劑(如生物制劑等),但是免疫抑制劑可導致機體細胞免疫功能下降,容易誘發潛伏結核分枝桿菌活動,從而引起活動性結核病。有關BD患者中LTBI的相關報道較少。Takeuchi等[13]報道5 000例使用英夫利西單抗治療的日本RA患者,其中3 000例患者加強了結核篩查和預防性治療,結核發病例數由11/2 000減少至3/3 000。因此,本研究依據國際專家組對LTBI的藥物治療建議,在使用BD藥物治療過程中特別是使用免疫抑制劑前,先行預防性抗結核治療[14]。 在66例高危BD患者(T-SPOT.TB 檢測陽性)接受預防性抗結核治療后為期27.9個月的隨訪中,未發現活動性結核病,這與國外相關研究結果基本一致[7,15-16]。所以,對BD患者的LTBI給予抗結核藥物預防具有一定臨床必要性。

目前LTBI的診斷缺乏金標準,在治療過程中應考慮防止活動性結核的發生以及減少抗結核藥物的不良反應,T-SPOT.TB檢測具有較高的特異性和敏感性,可應用于對BD患者的結核感染的篩查。本研究報道了BD患者中LTBI的發生率及對LTBI陽性BD患者進行預防性抗結核治療的意義,可有效降低免疫抑制劑誘導的結核病活動風險。