液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)檢測血漿腎素活性(PRA)的方法學建立和臨床應用評估

秦嘉 △

(1復旦大學附屬中山醫院檢驗科,2內分泌科 上海 200032)

中國高血壓患者總人數已突破3.3億,按病因可分為原發性和繼發性高血壓。其中原發性醛固酮增多癥(primary aldosteronism,PA)是繼發性高血壓中最常見的病因,在年輕高血壓人群中約占10%[1-4]。PA臨床表現為高血壓和(或)低血鉀的臨床綜合征,其作為一種“可治愈的高血壓”,若能早期診斷,可通過手術或藥物治療使血壓回到正常水平[5],可降低患者心血管事件的發生率,改善患者預后[6]。

腎素是由腎小球旁器釋放的一種蛋白水解酶,能催化肝臟分泌進入血漿中的血管緊張素原轉變成血管緊張素Ⅰ (angiotensin Ⅰ,Ang Ⅰ),從而增加醛固酮的生成。醛固酮是由腎上腺皮質球狀帶分泌的鹽皮質激素,主要生理功能是保鈉排鉀,通過調節血容量維持體液水鹽平衡[7]。臨床上推薦使用醛固酮/腎素活性比值(aldosterone to renin ratio,ARR)作為PA的初篩方法,再使用生理鹽水抑制試驗、開博通試驗等作為確認試驗,最后使用腎上腺靜脈取樣檢測醛固酮(AVS試驗)進行術前定位[8]。在這些臨床實驗中,準確檢測腎素活性-醛固酮濃度至關重要。

血漿腎素活性(plasma renin activity,PRA)水平非常低,僅為ng級,因此對檢測方法的靈敏度要求很高。19世紀70年代起使用放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)檢測[9],之后也開發出化學發光法檢測直接腎素濃度[10-11],這兩種方法是目前臨床常用的腎素檢測方法。免疫法可實現自動化操作,檢測快速、成本低,但單次僅能檢測一種靶標激素,特異性差、尤其是女性患者易出現交叉反應[12-13]。內分泌激素水平在機體病理狀態下波動范圍大,易出現極高/低值,而免疫分析法在此類情況下準確性與重復性的不足,令其在功能性試驗中無法正確反映患者的激素水平動態波動,從而影響臨床診斷的靈敏度及特異性。因此迫切需要尋找更靈敏、更準確的方法檢測PRA。

本文旨在建立質譜技術檢測PRA的方法,并結合多重反應監測(multiple reaction monitoring,MRM)技術,利用質譜平臺的高敏感性和高特異性準確定量PRA,早期快速篩查PA,從而更好地為臨床提供有效、準確的信息,為快速篩查診斷PA創造條件。

資 料 和 方 法

儀器和試劑AB SCIEX?Triple Quad 6500+LC-MS/MS系統,標準品為人血管緊張素Ⅰ乙酸鹽水合物(5 mg,上海市圓創生物科技有限公司);內標品為Ang Ⅰ穩定同位素內標arginine13C15N (5 mg,Anaspec,Fremont,成都康普尼生物科技有限公司);無激素正常人混合血漿SeraConTMⅡ (美國SeraCare Life Sciences公司);甲醇(德國Merck公司,色譜級);牛血清白蛋白(美國Sigma Life Science公司);苯甲基磺酰氟(德國Roche診斷公司);Tris Base堿(德國Roche診斷公司);甲酸(美國ROE scientific公司,高效液相色譜級)。

患者入組本研究納入2017年12月至2018年1月就診于復旦大學附屬中山醫院門診內分泌科并獲得醫囑檢測PRA的360名高血壓患者及同期在我院體檢中心體檢的296名表面健康人群。所有樣本獲取及使用過程均獲復旦大學附屬中山醫院倫理委員會批準及患者知情同意。

高血壓患者納入標準:原發性高血壓診斷依據為2010年中國高血壓防治指南。其中27例PA的診斷依據為2016年中國制定的《原發性醛固酮增多癥診斷治療的專家共識》。

體檢表面健康人群納入標準:年齡≥18歲;BMI為18.0～35.0 kg/m2;血壓無異常(<130/80 mmHg,1 mmHg=0.133 kPa);血鉀無異常(2.8～6.2 mmol/L);未服用降壓藥物或經過激素治療;無吸煙嗜酒;無嚴重器質性心臟病;無心功能3級及以上的心功能不全;無肝、腎功能不全;非妊娠、哺乳期婦女。

標本采集使用EDTA抗凝真空管采集患者靜脈血。盡快(2 h內)離心分離血漿,并分裝到尖底離心管內,-80 ℃凍存。

標準品配制 在2 mL無激素正常人混合血漿中準確溶解10 μg Ang I,配制成5 000 ng/mL的標準儲備液。將儲備液按照一定比例稀釋為0.337 5 (S1)、0.675 0 (S2)、1.350 0 (S3)、2.700 0 (S4)、9.000 0 (S5)及30.0000 ng/mL (S6)標準品。分裝后-80 ℃保存備用,不能反復使用。

質控品配制 在無激素正常人混合血漿中準確溶解10 μg Ang I,配制成5 000 ng/mL的標準儲備液。將儲備液按照一定比例稀釋為2.0、4.0及8.0 ng/mL質控品。分裝后-80 ℃保存備用,不能反復使用。

內標品配制 在含有2 mL 1% BSA的0.1 mol/L Tris (pH=6)工作緩沖液中準確溶解10 μg arginine13C15N,配制成5 000 ng/mL的內標儲備液。將Ang I 內標儲備液用10%甲酸水溶液稀釋至10 ng/mL。

樣本前處理將血漿、標準品、質控品和內標品取出平衡至室溫。(1)孵育反應[14]:分別取250 μL 標準品、質控品和患者血漿,加入50 μL孵育緩沖液,震蕩混勻后37 ℃孵育3 h。孵育結束后加入300 μL Ang Ⅰ SIS震蕩混勻后終止酶促反應。孵育緩沖液的配置:分別取121.1 g Tris Base與74.0 g EDTA,加入900 mL去離子水后超聲30 min,直至完全溶解后再用去離子水定容至1 000 mL。最后用冰醋酸調節pH至5.45～5.50,2～8 ℃保存。(2)固相萃取:使用Waters OASIS HLB uElution 96孔板進行抽提和萃取。每孔預先使用甲醇和5%甲酸水溶液1 mL對填料進行平衡和活化,加入孵育反應后的600 μL樣本(血漿或標準品)進行抽提和萃取,依次加入5%甲酸水溶液和20%甲醇水溶液各1 mL進行淋洗,分別將不同極性的雜質洗脫。最后使用250 μL甲醇將目標分析物以及穩定同位素內標洗脫入樣本收集板。

色譜分析條件與質譜條件色譜柱為Phenomenex Kinetex C18 (2.6 μm×100 mm×3.0 mm),柱溫55 ℃。流動相A為0.2%的甲醇水溶液,流動相B為0.2%的甲酸甲醇溶液,流速0.5 mL/min。按濃度梯度洗脫(表1)。將萃取得到的樣品上機檢測,每次進樣量為5 μL。質譜條件為Ang Ⅰ定量的轉換離子對(m/z)為433.1→647.5,錐孔電壓為46 V,碰撞能量為22 V;Ang I SIS定量的轉換離子對(m/z)為436.4→657.5,錐孔電壓為46 V,碰撞能量為22 V,質譜裂解信息見圖1。

表1 檢測流動相梯度Tab 1 Gradient of mobile phase

A:0.2% aqueous methanol solution;B:0.2% formic acid methanol solution.

圖1質譜裂解信息
Fig1Themassspectrometrycleavageinformation

方法學考察

預驗證 (1)特異性:使用無激素正常人混合血漿作為雙空白樣本,經前處理后重復進樣檢測5次,比較背景峰面積與定量檢測下限(lower limit of measuring interval,LLMI)峰面積,驗證該方法的特異性。背景峰面積/LLMI峰面積<20%即判斷為可接受。(2)基質效應:選取正常人混合空白血漿和流動相,經前處理后加入25 μL 9 ng/mL和100 ng/mL的標準品(標準品被稀釋10倍),4份標本分別進樣檢測5次,比較血漿基質和純溶液下的信號比值(ME%),ME%<100%±15%即判斷為可接受。(3)攜帶污染:在250 μL甲醇中加入25 μL濃度為100.0 ng/mL的標準品S7作為高值標本(10.0 ng/mL);在250 μL甲醇中加入25 μL 9.0 ng/mL標準品S5作為低值標本(0.9 ng/mL),低值標本進樣5次,高-低進樣反復5個循環。高-低值轉換樣品均值與低-低值轉換樣品均值之差小于低-低值轉換樣品的3倍標準差(standard deviation,SD)即判斷為可接受。(4)重復性:將標準品稀釋至110% LLMI (0.372 ng/mL)、90% LLMI (27.000 ng/mL)和50% [(LLMI+ULMI)15.169 ng/mL,ULMI:upper limit of measuring interval (定量檢測上限)]作為待測樣品。經前處理后每種濃度的樣本重復進樣20次,計算SD和CV,CV<15%即判斷為可接受。

性能驗證

定量下限 稀釋標準品,當標準品濃度為0.337 5、0.084 4和0.042 2 ng/mL,每個濃度重復檢測10次,將同時滿足CV<15%、檢測偏倚(deviation,Dev)<10%且信噪比>20∶1的最低濃度值定為定量檢出限。

線性評價 將濃度為100 ng/mL的標準品稀釋為6個濃度(30.000 0、9.000 0、2.700 0、1.350 0、0.675 0、0.337 5 ng/mL),重復檢測3次取均值。各濃度的Dev<10%,CV<15%且曲線的回歸系數(r2)>0.99可判斷為呈線性。

不精密度評價 使用高(8.0 ng/mL)、中(4.0 ng/mL)、低(0.25 ng/mL) 3個濃度水平的質控品作為待測樣品,分別同時檢測20次,評價批內不精密度;將混合血漿分裝于-20 ℃保存,連續檢測3天,每天重復3次,評價批間不精密度。LLMI濃度3倍附近低值CV<20%,其余CV<15%即判斷為可接受。

準確度評價 在3個濃度水平的質控品(2.0、4.0和8.0 ng/mL)中同時添加標準品S4 (2.7 ng/mL),每份樣本重復檢測5次取均值,并與理論值進行比較計算Dev。準確度Dev<15%且低濃度Dev<20%即判斷為可接受。回收率需滿足80%～120%。

稀釋一致性 將濃度為100 ng/mL的標準品S7稀釋至3個濃度(20、10、5 ng/mL),經前處理后每個濃度進樣檢測5次,當滿足濃度>3倍LLMI時,回收率在100.0%±15.0%,CV<15%即判斷為可接受。

樣本穩定性及儲存穩定性 選取低、高各2組混合血漿樣本分別置于25、4、-80 ℃保存15 h后進行檢測,每組檢測4次,計算均值與CV%,CV<15%即判斷為可接受。血液樣本采集后處理穩定性:采用隨機數表法(不重復抽樣)在360例高血壓患者標本中隨機選取20例血樣,按3種不同處理要求進行血漿分離,分別檢測3種處理后的PRA計算均值與CV%,CV<15%即判斷為可接受。標本采集后立即分離血漿,于37 ℃孵育3 h;標本采集后立即分離血漿,于4 ℃放置5 h后于37 ℃孵育3 h;標本采集后靜置5 h,隨后分離血漿,于37 ℃孵育3 h。

臨床評估 建立生物參考區間:表面健康人群根據性別進行分組,并統計分析是否存在性別差異,如有差異則分組建立參考區間;通過相關性分析判斷年齡和檢測值之間是否存在相關性,如存在相關性則根據年齡分段建立參考區間。判斷健康人群結果是否為正態分布,非正態分布使用2.5%與97.5%百分位數作為參考區間上下限。方法學比較:與RIA檢測所得PRA結果進行一致性與偏倚評價。臨床應用評估:使用LC-MS/MS和RIA法所得結果計算ARR,評價兩者比值對PA診斷的靈敏度和特異性,綜合評價診斷性能。

統計學分析使用SPSS 17.0 軟件計算均值、SD、CV、Dev和回收率。使用Skewness-Kurtosis檢驗程序判斷數據正態性;使用Stem-and-Leaf&Box Plots程序剔除離群值;使用非參數秩和檢驗統計分析是否存在性別差異;使用Spearman相關性分析判斷年齡和檢測值之間是否存在相關性。方法間結果比較使用兩獨立樣本的t檢驗進行分析,P<0.05為差異有統計學意義。ROC曲線評價自建質譜方法與RIA所得結果對于PA診斷的靈敏度和特異性。

結 果

方法學驗證

預驗證

LC-MS/MS檢測 標準品S3和血漿標本Ang Ⅰ (m/z:433.1→647.5)及其內標物Ang Ⅰ-IS (m/z:436.4→657.5)的色譜圖見圖2,保留時間分別為2.06和2.05 min。

A and B:The chromatogram of the standard S3 Ang I and Ang I-IS;C and D:The chromatogram of the plasma sample Ang I and Ang I-IS.

圖2LC-MS/MS檢測PRA的色譜圖
Fig2ChromatogramsofPRAdetectedbyLC-MS/MS

特異性 雙空白血漿重復進樣5次所得到背景峰面積/LLMI峰面積分別為3.61%、3.02%、4.14%、2.43%和0.99%,均小于20%。另外,背景峰面積/預期IS峰面積分別為0.11%、0.18%、0.18%、0.09%和0.09%,均小于5%。以此驗證該方法的特異性滿足要求。

基質效應 添加低、高值(9 ng/mL、100 ng/mL)標準品的血漿基質和純溶液下的信號比值(ME%)分別為93.88%(低濃度)和103.02%,說明血漿基質對低、高濃度樣本的影響分別表現為離子抑制和離子增強,影響幅度在15%之內則滿足建議要求。

攜帶污染 高-低值轉換樣品均值與低-低值轉換樣品均值分別為0.353和0.372,兩者的差值(0.019)小于3倍低-低值轉換樣品SD,判斷為可接受。

重復性 110% LLMI (0.372 ng/mL)、90%LLMI (27.000 ng/mL)和50%(LLMI+ULMI)(15.169 ng/mL) 3種濃度稀釋標準品的CV分別為5.17%、2.00%和7.93%,均<15%即判斷為可接受。

性能驗證

線性評價 將濃度為100 ng/mL的標準品稀釋為6個濃度(30.000 0、9.000 0、2.700 0、1.350 0、0.675 0、0.337 5 ng/mL),重復檢測3次取均值。LLMI濃度點及其余濃度點的Dev<10%且CV<15%則滿足建議要求。PRA的回歸方程是y=0.091 7x+0.010 3,相關系數r2=0.99,PRA的線性范圍為0.084 4～30.000 0 ng/mL。

不精密度評價 低(0.25 ng/mL)、中(4.0 ng/mL)、和高(8.0 ng/mL) 3個濃度水平的PRA溶液(質控品)批內不精密度分別為3.54%、1.32%和1.88%,日間不精密度分別為5.69%、2.22%和1.92%。實驗結果顯示3濃度水平質控品的批內和日間CV 均<15%,滿足應用建議要求。

準確度評價 實驗結果顯示低、中、高3個濃度水平質控品的Dev分別為-8.81%、2.18%和2.62%,Dev均<15%,滿足應用建議的要求。回收率為91.28%～102.62%,符合80%～120%的標準。

表3 PRA稀釋一致性Tab 3 The dilution consistency of PRA

Level 1:20 ng/mL;Level 2:10 ng/mL;Level 3:5 ng/mL.

樣本穩定性 儲存穩定性:低、高各2組混合血漿樣本在25、4、-80 ℃保存15 h后,4次檢測結果差異無統計學意義(P=0.14)。血漿樣本采集后處理穩定性:20例隨機血樣按A1、A2和B方案進行血漿分離,3種樣本處理后的PRA差異無統計學意義(P>0.05),以A1為100%,換算為A2和B組的百分比繪制圖3。

方法學比較360例高血壓樣本中臨床確診為PA的樣本為27例。比較分析LC-MS/MS和RIA結果之間的相關性,Spearman相關檢驗結果顯示r2=0.81,P<0.05,兩者結果一致性較好(圖4)。Bland-Altman plot圖橫坐標為兩方法所得結果的均值,縱坐標為兩方法之間的相對偏差。與RIA結果相比,LC-MS/MS方法的檢測結果的平均偏差為-18.5% 。

臨床應用評估根據兩方法檢測結果計算ARR,繪制兩種方法的ROC曲線(圖5),曲線下面積LC-MS/MS為0.983(P<0.05),RIA為0.894 (P<0.05)。LC-MS/MS所得PRA計算的ARR對PA的診斷性能更佳。以30作為ARR的切點,LC-MS/MS的靈敏度和特異性分別為96.3%和91.0%,雖然RIA的診斷特異性(99.4%)較好,但靈敏度(33.3%)損失嚴重。

Using random number table method,Specimen selected from blood samples of 360 patients with hypertension.

圖3血漿樣本采集后處理穩定性
Fig3Thetreatmentstabilityaftertheplasmasamplecolletion

Solid lines represented the mean negative bias.Dotted lines represented 95% limits of agreement.

圖4LC-MS/MS和RIA檢測PRA的BA圖
Fig4Bland-AltmananalysisbetweenLC-MS/MSandRIAforPRA

討 論

我們使用AB SCIEX?Triple Quad 6500+系統建立了LC-MS/MS檢測PRA的方法。PRA的定量分為兩個步驟:(1)經過孵育血漿中的血管緊張素原轉換為Ang Ⅰ;(2)定量檢測Ang Ⅰ。所以PRA的檢測實際是Ang Ⅰ水平變化的檢測。

PRA的檢測在先前的研究中室間一致性結果較差,這可能是由于標本的分析前和分析中因素等變量所造成。我們的方法在建立過程中不斷優化反應條件,對標本保存方式、孵育時間溫度、SPE提取損失、樣本吸附等方面進行多次實驗,盡可能減少實驗條件對檢測造成的分析前和分析中誤差,保證PRA定量的準確性。

圖5LC-MS/MS與RIA的ROC曲線
Fig5ThereceiveroperatingcharacteristiccurveanalysisbetweenLC-MS/MSandRIA

在分析前誤差分析中,我們針對樣本的采集后處理穩定性和儲存穩定性進行了詳盡的分析。PRA標本的標準采集轉運流程應為:血樣采集后30 min內冰浴送檢并離心分離血漿,但在實際操作中,尤其在住院患者的采樣中執行難度較大。在我們的實驗中,標本采集后即刻離心分離血漿,與全血保存5 h后分離血漿進行檢測,差異無統計學意義,這也保證了病房采集標本后未能及時送檢不會帶來結果偏差。在分離血漿后樣本儲存的穩定性實驗中,血漿標本可在室溫、4℃冷藏和-20 ℃冷凍情況下穩定15 h。這也保證了非門診時間段采樣標本分離血漿后儲存的穩定性。

綜上所述,本研究利用高靈敏度和高特異性的質譜平臺準確定量PRA。該方法已在復旦大學附屬中山醫院應用于臨床,結果得到了認可。但質譜方法在臨床的推廣仍存在一定局限性。昂貴的儀器、較高的耗材成本、操作人員專業欠缺、實驗室自建檢測方法建立有待規范和無法與實驗室信息系統對接等問題仍需進一步解決。