三七粉聯合玻璃體切除術對增殖性糖尿病視網膜病變患者的療效觀察及機理探究

韓夢雨 ，王志軍，李偉，高征，秦亞麗，鄧婷婷，訾迎新，鄧宇，金明

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是目前工作年齡人群第一位的致盲性疾病[1]。增殖性糖尿病視網膜病變（proliferative diabetic retinopathy，PDR）是DR 的增殖階段，其特點是視網膜缺血、缺氧和異常新生血管形成，導致玻璃體出血和牽引性視網膜脫離等病變。PDR 是導致非外傷性玻璃體積血首要原因，嚴重危害患者視力甚至致盲[2-6]。玻璃體切除術是目前臨床上治療PDR 引發玻璃體積血的主要方式，但病理性新生血管與視網膜粘連緊密，不僅術中極易出現醫源性視網膜裂孔及大量出血，而且術后視力恢復差，易出現黃斑水腫、牽拉性視網膜脫離、玻璃體再次出血等并發癥，對醫生和患者均會帶來一定挑戰與壓力[7]。三七粉為五加科植物三七的根及根莖，相關研究[3-4]表明其對玻璃體積血、視網膜出血等眼底血證具有較好的療效。本研究通過觀察比較2 組患者術前、術中、術后臨床療效差別，檢測2 組患者玻璃體原液血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及纖維連接蛋白（fibronectin，FN）的濃度差異，研究單味三七粉聯合玻璃體切除術組患者與單純行玻璃體切除術組患者的臨床療效差別及其潛在機理所在。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2016 年1 月—2017 年9 月就診于中日友好醫院眼科的PDR 患者（均為2 型DM)共29 例（29只眼）。將受試患者按初次就診時間選擇簡單隨機（拋硬幣）法分為治療組和空白組，治療組14 例，男性8 例，女性6 例；年齡（54.57±11.47）歲；糖尿病病程（10.86±7.32）年；空腹血糖（6.6±1.28）mmol/L；糖化白蛋白（glycated albumin,GA）（13.51%±1.97%）；甘油三酯（2.02±1.97）mmol/L；總膽固醇（3.02±1.97）mmol/L；眼壓（13.93±2.09）mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）；最佳矯正視力（bestcorrected visual acuity，BCVA）＞0.5 者1 只眼，0.3～≤0.5 者1 只眼，0.1～≤0.3 者4 只眼，0.05～≤0.1者2 只眼，≤0.05 者6 只眼。空白組15 例，男性9 例，女性6 例；年齡（51.13±11.84）歲；糖尿病病程（11.40±4.61）年；空腹血糖（6.50±1.12）mmol/L；GA（13.60%±2.03%）；甘油三酯（1.53±0.52）mmol/L；總膽固醇（2.67±0.89）mmol/L；眼壓（14.00±2.56）mmHg；BCVA＞0.5 者1 只眼，0.3～≤0.5者1 只眼，0.1～≤0.3 者2 只眼，0.05～≤0.1 者2 只眼，≤0.05 者9 只眼。2 組患者性別、年齡、空腹血糖、GA、糖尿病病程、甘油三酯、總膽固醇、眼壓、BCVA等一般資料比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標準、納入標準及排除標準

PDR 診斷標準[8]：（1）出現視網膜新生血管（neovascular elsewhere，NVE）或視乳頭新生血管（neovascular of the disc，NVD），當NVD＞1／4～1／3 視乳頭直徑（papilla diameter，PD）或NVE＞1／2PD，或伴視網膜前出血或玻璃體出血時稱“高危增生型”（high risk PDR）；（2）出現纖維膜，可伴視網膜前出血或玻璃體出血；（3）牽拉性視網膜脫離，合并纖維膜，可合并或不合并玻璃體積血，也包括虹膜和房角的新生血管。

玻璃體積血分級標準[9]：I 級 玻璃體積血，可見視乳頭及視網膜血管；II 級 輕度玻璃體積血，模糊可見視乳頭；III 級 中度玻璃體積血，看不見視乳頭及視網膜血管，可見眼底紅光反射；IV 級 重度玻璃體積血，看不見眼底，也無眼底紅光反射。

納入標準：（1）自愿參加本臨床試驗，簽署知情同意書；（2）診斷明確（由同一位醫師），玻璃體積血II 級以上，且玻璃體積血病程≤2 周；（3）空腹血糖控制在3.9～8.0 mmol/L 以內，糖化白蛋白11.0%～16.0%，高血壓患者血壓控制在130/80 mm Hg 以下；（4）患者均為第1 次手術，并在術前3 個月內未接受過藥物玻璃體腔注射及全視網膜光凝治療。

排除標準：（1）伴新生血管性青光眼和(或)嚴重白內障的PDR 患者；（2）有嚴重的全身性疾病、年齡較大、近期發生過心腦血管意外的患者；（3）有可能影響視力的其他眼部疾病的患者；（4）凝血功能指標異常者；（5）排除其他疾病引起的單純的玻璃體積血及視網膜脫離等；（6）玻璃體積血病程＞2 周者。

1.3 治療方法

治療組給予中日友好醫院中藥制劑室供應的三七粉4.5 g，沖服，每日2 次（時間為8:00 和20:00），2周后行玻璃體切除術。

空白組不予任何干預，2 周后行玻璃體切除術。

手術過程：2 組患者由同一位高年資醫師在局部球后麻醉下完成手術，采用Alcon consellation 玻切超乳一體機、23G 三通道睫狀體平坦部玻璃體切除術，術中所有患者先行白內障超聲乳化，術中切除混濁玻璃體及積血，剝除病理性新生血管膜解除牽拉，并行全視網膜激光光凝術，如遇視網膜已脫離的情況，術中根據需要選擇眼內填充物(硅油、惰性氣體或平衡鹽溶液等)，最后植入人工晶狀體，關閉三通道。

1.4 觀察指標及檢查方法

BCVA：采用標準對數視力表檢測視力后經同一位驗光師驗光矯正。

眼壓：采用日本Topcon 公司非接觸式眼壓計測定，連續測定3 次，取平均值；

玻璃體積血吸收程度：眼部B 超（天津索微）評估玻璃體積血吸收體積；光學相干斷層掃描（optical coherence tomography,OCT）（日本Topcon 公司）評估視網膜黃斑中央凹厚度；熒光素眼底血管造影（fluorescein fundus angiography,FFA）（德國海德堡血管造影儀HRA plus II）評價視網膜微血管瘤、出血、滲出面積及新生血管變化等。

手術時間：德國Zeiss 手術錄像系統記錄術中手術時間。

玻璃體原液取材方法：所有患者術眼常規術前使用復方托吡卡胺滴眼液0.5 h 快速散瞳，手術室內常規消毒鋪無菌孔巾，0.75%布比卡因、2%利多卡因等比例混合后球后注射5.0～6.0 mL。于術中行標準三通道經睫狀體平坦部玻璃體切割術，預置灌注頭，玻璃體切割頭及導光照明纖維進入眼內，玻璃體切割手術開始時關閉灌注管，于切割器開口處用無菌2 mL注射器吸引切割出的非稀釋的玻璃體原液0.5～0.8 mL，分成2 份移入已消毒的Eppendorf 管中（每個Eppendorf 管中約250～300 μL），液氮轉運至-80℃冰箱保存在中日友好醫院臨床醫學研究所生物樣本庫。

VEGF、FN 濃度：VEGF、FN 濃度的測量使用酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法，人VEGF、FN 酶聯免疫試劑盒購自北京瑞格博生物公司，根據試劑盒操作說明書進行操作。使用前先將試劑盒室溫下平衡0.5 h。空白孔不加樣，只加顯色劑A、B 和終止液用于調零。標準品孔中每孔加入稀釋好的標準品50 μL，零孔加入樣品稀釋液50 μL，在各孔中加入生物素化抗原工作液50 μL。樣品孔中加入稀釋2 倍樣品50 μL，加入生物素化抗原工作液50 μL，輕輕搖晃，用封板膜封住反應孔，37℃溫箱孵育60 min；清洗5 次后每孔再加入親和素-HRP50 μL，用封板膜封住反應孔，37 ℃孵箱孵育60 min；然后第二次洗滌（清洗5 次）后，在每孔中加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 min 后在每孔中加入終止液50 μL，（此時藍色立轉黃色）酶標儀450 nm 處讀數，在10 min 內測定各孔吸光度（OD）值，根據定比稀釋標準品的OD 值繪制標準曲線，根據樣品OD 值和標準曲線，計算VEGF 含量。FN 的檢測步驟與VEGF 相同（樣品孔使用原液檢測）。實驗操作均嚴格按其說明書操作程序進行測定，且每份標本均重復3 次測定。

1.5 療效標準

玻璃體積血吸收療效標準[10-11]：（1）顯效 玻璃體積血基本吸收，由Ⅲ～Ⅳ級轉化為Ⅰ級；視力提高大于2～3 行；從無光感增加到0.05；手動／眼前增加到0.1；FFA 微血管瘤數量、滲出面積、出血3 項中有2 項以上改善，且B 超檢查結果顯示玻璃體腔內混濁光團數明顯降低；（2）有效 玻璃體積血大部分吸收，由Ⅲ～Ⅳ級轉化為Ⅱ級；視力提高大于1～2 行；從無光感增加到0.02；手動／眼前增加到0.08；FFA微血管瘤數量、滲出面積、出血3 項中有1 項以上改善，且B 超檢查結果顯示腔內混濁光團數有所降低；（3）無效 玻璃體積血少部分或無吸收，眼底結構仍窺不清。視力無改善甚至加重；FFA 微血管瘤數量、滲出面積、出血3 項中無改善，且B 超檢查結果顯示腔內混濁光團數無改善。總有效率（%）=（顯效+有效）/患者只眼×100%。

1.6 統計學方法

運用SPSS20.0 對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（）表示，正態分布計量資料采用獨立樣本t 檢驗或單因素方差分析，非正態數據采用非參數檢驗，計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 術前2 組患者BCVA 改善及玻璃體積血吸收情況

BCVA 治療組視力提升4 只眼，空白組視力提升0 只眼，組間差異有統計學意義（Z=-2.64，P=0.010）（表1）。

表1 2 組患者術前干預2 周及術后3 個月視力改善情況（眼只數）

玻璃體積血吸收情況 治療組玻璃體積血顯效2 只眼，有效5 只眼，無效7 只眼，積血吸收改善7 只眼，總有效率50%；空白組玻璃體積血顯效0 只眼，有效2 只眼，無效13 只眼，積血吸收改善2只眼，總有效率13.3%，組間差異具有統計學意義（χ2=4.55，P=0.030）。

2.2 術中手術時間

治療組（23.13±7.84）min，空白組（28.74±4.29）min，組間差異有統計學意義（t=2.42，P=0.020）。

2.3 術后3 個月的視力及眼壓

BCVA：治療組14 例14 只眼患者中，視力提高9 只眼(64.0%)；空白組15 例15 只眼患者中，視力提高5 只眼(33.0%)，組間差異有統計學意義(Z=-2.12，P=0.030)（表1）。

眼壓：治療組眼壓（16.14±4.06）mm Hg，空白組眼壓（19.13±2.75）mm Hg。組間差異有統計學意義（t=2.34，P=0.030）。

2.4 2 組患者間玻璃體中VEGF 及FN 濃度

治療組VEGF 濃度（224.91±41.10）pg/mL，空白組VEGF 濃度（807.64±98.20）pg/mL，差異有統計學意義（t=20.57，P=0.000）。治療組FN 濃度（3.88±0.19）μg/mL，空白組FN 濃度為（4.29±0.25）μg/mL，差異有統計學意義（t=5.00，P=0.000）。

3 討論

玻璃體積血是引起PDR 患者視力下降甚至致盲的重要原因，非正常的新生血管形成是導致這一系列眼內病理變化的重要致盲因素[12]。玻璃體切除術是其主要治療方法。但多數PDR 患者病情比較棘手，術中難度較大，手術帶來的可能并發癥等也局限了玻璃體切除術在PDR 引起的玻璃體積血中的單一應用及治療前景[7]。因此，尋找更加完善的治療方式尤為重要。本研究在術前未注射抗VEGF 藥物治療，主要考慮，目前PDR 引發的玻璃體積血患者，術前抗VEGF 治療尚未得到指南或者專家共識，且相關文獻認[13]為PDR 引發玻璃體積血的患者術前抗VEGF 藥物的應用有可能會導致PDR 進展。

三七粉為五加科植物三七的根及根莖，為“血證要藥”，具有“止血又活血，止血不留瘀”特點，為中醫眼科臨床治療PDR 導致的玻璃體積血的常用組分藥物。前期研究表明，三七粉可以通過以下機制發揮防治PDR 的功用：縮短凝血時間，增加凝血酶濃度，使血小板數量顯著增加等來發揮止血作用[14]；糾正血糖、血脂代謝及降低視網膜GFAP 的表達對DR大鼠的視網膜起到保護作用[15-16]；抑制視網膜色素上皮細胞VEGF 的釋放弱化視網膜新生血管生成[17]。

VEGF 是目前研究所知作用最強、最直接的促新生血管生成的細胞因子之一，且VEGF 與多種眼內新生血管性疾病（包括PDR）的發生發展密切相關[12]。FN 是細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的重要組成部分，目前關于FN 與PDR 發生發展關系的研究甚少。病理性新生血管是PDR 期典型病理特征，除內皮細胞外，ECM 也與血管的發生有關，其在內皮細胞的遷移、黏附、管腔重構中起重要作用。相關動物實驗提示FN 在DR 大鼠的視網膜毛細血管細胞外基質中過度表達，促進視網膜微血管內皮細胞增生、毛細血管瘤形成[18]。既往研究也表明FN 刺激視網膜色素上皮細胞、巨噬/單核細胞、T/B 淋巴細胞等遷移至視網膜前或玻璃體內,導致病理纖維化及異常增殖等，形成病理性視網膜前膜及牽拉性視網膜脫離等病變[19-21]。在本研究中我們觀察到，治療組患者玻璃體VEGF 及FN 含量明顯低于空白組，我們推測三七粉可以通過抑制PDR 患者VEGF 的表達這一通路，從而阻止視網膜前病理性新生血管的生長，有效促進術前PDR 患者玻璃體積血吸收、促進患者術前視力提升、縮短PDR 患者手術時間、提升患者術后視力、降低患者術后高眼壓發生率。其次，三七粉可以通過抑制PDR 患者玻璃體中FN 的表達從而阻斷其促進ECM 成分合成的過程，進而阻斷或延緩PDR 的視網膜前膜的形成。

本研究突顯出單味中藥三七粉的術前干預對PDR 患者臨床治療的潛在療效。三七粉可能通過抑制PDR 患者玻璃體中VEGF 及FN 的表達來發揮相應治療作用。基于此，可以認為單味三七粉口服可作為PDR 導致的玻璃體積血患者術前輔助治療手段之一。但由于PDR 的形成涉及多種因子，可能存在多條影響途徑，故三七粉是直接作用于這2 種因子來發揮作用還是通過影響其他細胞生長因子或炎性因子間接發揮作用，其進一步的作用機理仍不清晰，需要今后進一步的基礎及臨床試驗來明確，從而有可能為PDR 的臨床防治提供新的有效思路和方法。