苗藥痛風停對痛風性關節炎模型大鼠炎癥因子及滑膜病理的影響

1.貴州中醫藥大學第二附屬醫院，貴州 貴陽 550001；2.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550001

痛風性關節炎(goutyarthritis，Gout)是尿酸鹽晶體沉積于人體內所導致的一種炎性疾病，急性期以關節紅、腫、熱、痛為主要臨床特征，最終可導致關節變形、骨骼損毀，甚則等影響到內臟器官功能，出現腎功能衰竭[1]。研究顯示尿酸鹽結晶作為炎癥激發因子，通過Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)/髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)信號途徑誘導炎癥反應，機體生成白細胞介素(Interleukin，IL)、腫瘤壞死因子ɑ(Tumor necrosis factor，TNF-ɑ)等多種細胞因子，導致炎癥瀑布反應[2]。《丹溪心法》中記載：“痛風者，四肢百節走痛，方書謂之白虎歷節風證是也”，認為是風、熱、痰、濕相互膠結為患，阻滯經脈氣血所致；苗醫認為痛風屬“熱經病”，多由于“風、熱、火、濕”等邪氣熾盛、血脈受阻，邪毒留滯筋骨所致，其認識與祖國醫學殊途同歸。治療用藥上多以流轉氣血、清熱解毒、去除邪熱為法，達到“趕邪”的目的。我科于臨床中借鑒中醫、苗醫理論研創了“痛風停”方，該方中三七草、大澤蘭、田七草、觀音草、芭蕉根等藥物屬苗醫藥范疇，能“趕邪祛毒、行血消腫”，配合石膏、虎杖、黃柏等藥物，達到活血散結、清熱解毒、利水消腫的目的，臨床中發現苗藥“痛風停”方能較好的減輕痛風性關節炎急性期炎性腫脹、疼痛。本研究通過建立大鼠痛風性關節炎模型，觀察痛風停對血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等炎癥因子及關節滑膜組織的影響，探討苗藥痛風停方對痛風關節炎的抗炎作用機理。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及分組 成年雄性SD大鼠72只，清潔級，體重(240±20)g，購置于重慶騰鑫生物技術有限公司，證號SCXK(京2013-0007)。所有動物飼養于貴陽中醫學院實驗動物中心，同等飼養條件。按隨機數字分組方法分為空白對照組、模型對照組、痛風停低劑量組、中劑量組、高劑量組和秋水仙堿對照組共6組，每組12只。

1.2 主要材料及設備 實驗藥物苗藥痛風停湯由三七草(銳徒清)30 g、大澤蘭(銳米菜)15 g、田七草(銳天梯)15 g、觀音草(銳油沙)15 g、芭蕉根30 g等藥物組成(由貴州中醫藥大學第二附屬醫院提供)。對照藥物秋水仙堿片(北京嘉林藥業股份有限公司，批號：20161001)；尿酸鈉(美國Sigma公司，批號：U2875-5G)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號P0010S)；DBA、PV-9000(北京中杉金橋生物)；IL-1、IL-6、IL-8檢測ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究院)；切片機(德國萊卡，型號：RM2015)，顯微鏡(日本奧林巴斯，型號：BX51T-PHD-J11)；低溫高速離心機(SCILOGEX，型號：D3024R)；自動酶標讀數儀(美國BioTek公司)；脫色搖床(國立常州試驗設備研究所)；超凈工作臺(蘇潔凈化有限公司)。

2 實驗方法

2.1 藥物制備 將上述苗藥加水1000 mL浸泡1 h后煎煮30 min，再加水500 ml煎煮30 min，兩煎混合過慮后濃縮至含生藥物1 g/mL，儲存備用。秋水仙堿取適量加蒸餾水配置成1 g/mL混懸液，儲存待用。

2.2 造模方法 按照Mc Carty DJ的造模方法[4]，除空白對照組外，其余各組實驗動物用20%烏拉坦(5 mL/kg靜脈注射)麻醉，然后將大鼠雙側膝關節周圍脫毛，消毒皮膚，輕彎曲膝關節，于關節正中或側方進針，用6號注射針將尿酸鈉溶液10 mg(0.4 mL)及多粘菌素B 0.1 mL(10U/mL)注入大鼠膝關節腔，制備急性痛風性關節炎動物模型。造模成功后，病變關節明顯腫脹、發熱，患肢活動受限。

2.3 給藥方法 痛風停方的成人(60 kg)每日劑量為生藥1.25 g/kg，根據人與大鼠體質量確定大鼠的等效劑量為中劑量(7.5 g/kg)，等效劑量的1/2倍為低劑量(3.75 g/kg)，等效劑量的2倍為高劑量(15 g/kg)。陽性藥對照組秋水仙堿取等效劑量30 mg/kg[5]。從造模第1天開始，連續灌胃7 d，每天分2次給藥，模型對照組和空白對照組灌服等量生理鹽水。

2.4 觀測指標

2.4.1 各組大鼠一般情況觀察，包括活動、精神狀態、毛發、進食、反應能力等方面。

2.4.2 外周血TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8濃度檢測 股動脈采集外周血，離心后收集血清送檢，使用ELISA檢測方法對TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8進行檢測，嚴格按照ELISA試劑盒操作說明書步驟進行操作。

2.4.3 關節滑膜組織病理檢測 取各組大鼠膝關節滑膜組織，經固定后，常規石蠟包埋，4μm切片，常規用二甲苯脫蠟，經各級乙醇處理至水洗，然后染色、固定。具體操作步驟嚴格參照實驗步驟進行。

3 結果

3.1 一般情況 成功復制痛風性關節炎大鼠模型，模型組大鼠明顯動作遲緩，反應遲鈍，活動量明顯減少，食量減少，精神萎靡，毛發無光澤。與模型組相比，痛風停湯中、高劑量組與秋水仙堿組大鼠一般情況均較治療前明顯改善，進食量較多，反應良好，活動量接近正常。

3.2 痛風停方能夠降低模型大鼠外周血IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α的濃度 比較各組大鼠外周血檢測結果，與空白組比較，造模組大鼠血清IL-1、IL-6、IL-8、 TNF-α顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，痛風停低、中、高劑量組及秋水仙堿組均有顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；痛風停高劑量組檢測結果低于秋水仙堿組，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠外周血IL-1、IL-6、IL-8、 TNF-α濃度

續表1 表1 各組大鼠外周血IL-1、IL-6、IL-8、 TNF-α濃度

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與秋水仙堿組比較，cP<0.05。

3.3 各組大鼠關節滑膜病理 與空白組比較，模型組滑膜組織增厚，大量淋巴細胞浸潤，血管增生；與模型組比較，痛風停低劑量組滑膜增生、淋巴細胞浸潤均較輕，痛風停中、高劑量組滑膜增生則不明顯，淋巴細胞浸潤顯著減少，秋水仙堿組與痛風停低劑量組改變近似。如圖1～6所示。

4 討論

痛風性關節炎患病率逐年增加，發病年齡也趨向年輕化，而尿酸鹽是炎癥誘發的啟動因素。研究顯示痛風的發生機制較多，其中TLRs/MyD88炎癥通路較為集中[6]。機體內尿酸鹽晶體暴露后誘導TLRs/MyD88通路激活，觸發組織細胞釋放炎癥因子TNF-α、IL-l、IL-6、IL-8、干擾素γ等，誘使中性粒細胞脫顆粒和單核巨噬細胞聚集、吞噬[7-10]，并激活NF-κB炎癥通路[11]，使炎癥反應持續放大。

IL是一類具有多重功效的細胞因子，可由多種細胞產生，在炎癥的發生、發展中起著重要作用。IL-1是一種由單核細胞、巨核細胞分泌，常常和TNF-α共同發揮“核心”致炎的作用，是痛風主要的促炎因子[12]；同時IL-1還誘導內皮細胞表達粘附因子，使白細胞聚集于關節腔內[13]。IL-6主要由內皮細胞、單核細胞等產生，并刺激B細胞產生抗體，以激活效應性T細胞，還可以誘導血管上皮細胞形成血管翳，激活血管內皮細胞上的粘附因子[14]。IL-8是一種趨化性細胞因子，主要是由單核細胞、上皮細胞等分泌，參與炎癥和體內的免疫防御反應。研究證實[15-16]上述三種白介素在痛風性關節炎的炎癥發生、發展中起著重要作用。TNF-α主要由單核/巨噬細胞產生，是炎癥反應過程中出現最早、最重要的炎性介質，能激活中性粒細胞和淋巴細胞，調節并促使其他細胞因子的合成和釋放[17]，與IL-l、IL-6、IL-8形成聯動，誘導炎癥呈瀑布樣發展。因此，我們認為TNF-α、IL-l、IL-6、IL-8等炎癥因子是在痛風性關節炎炎癥反應急劇發生發展的重要介質，對上述炎癥介質的抑制，是有效減輕痛風炎癥的手段。

苗醫理論認為痛風關節炎是由于各種原因導致“邪毒”、“風毒”、“火毒”及“瘀毒”等侵襲所引起，屬于“熱經病”范疇，治療當予“趕毒”(瑪汝務翠)為法，痛風停方源于苗族經驗方，由三七草(銳徒清)、大澤蘭(銳米菜)、田七草(銳天梯)、觀音草(銳油沙)、芭蕉根、虎杖、生石膏、黃柏等組成，全方具有祛邪解毒、活血化濁、清熱利水、消腫散結之效，可有效減輕痛風患者關節疼痛，可有效降低患者炎癥指標[18-19]。本實驗結果顯示，造模大鼠血清IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α濃度顯著升高，且滑膜組織增生、淋巴細胞浸潤，經苗藥痛風停治療后，能減輕大鼠關節炎癥反應，顯著降低外周血中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α的濃度，并抑制關節滑膜細胞增殖，充分說明苗藥痛風停通過抑制機體多種炎癥因子的釋放，從而控制痛風性關節炎的炎癥反應。