日糧添加甘露寡糖對沙門氏菌感染肉雞盲腸相關參數(shù)及腸道細菌含量的影響

朱孟玲，田為剛

腸炎沙門氏菌PT4被認為是人沙門氏菌感染的主要血清型。在各種腸道腸炎沙門氏菌噬菌體類型中，噬菌體PT4在雞中致病性最強。此外，在同一階段類型的腸型鏈球菌中，有報道稱其傳染性的毒力發(fā)生變化（Gast和Benson，1995）。目前家禽養(yǎng)殖的模式增加了沙門氏菌感染的可能性，因為保護性微生物群的發(fā)展相對緩慢。健康成年家禽口服接種腸道菌群可以保護幼雛免受沙門氏菌的定植，這種預防性的方法稱為競爭排斥。但競爭排斥的一個主要缺點是其保護有限，需要改進保護效果。人們對某些不溶性碳水化合物的特異性和選擇性及其對人類、家禽和其他動物胃腸道中個別微生物種類的影響也很感興趣。人體以果糖、甘露糖和半乳糖為基礎的低聚糖對腸道菌群的影響表明，這些不可消化的糖對腸道具有益處。Hidaka和Hireayama（1990）報道，果寡糖在腸道內提供了一種底物，只有所謂的“有益細菌”，如雙歧桿菌和乳酸菌可以利用。將果寡糖添加到雞飼料中，并與來自雞盲腸內容物培養(yǎng)菌混合使用比單獨使用更能有效降低沙門氏菌的定植（Bailey等，2016）。人類和雞的胃腸道下部有由許多屬組成的不同的細菌群落，這些細菌包括雙歧桿菌、擬桿菌、真細菌、革蘭陽性球菌、梭菌和乳酸菌等小群細菌。雙歧桿菌和乳酸菌通常被認為是有益的微生物，其創(chuàng)造了不利于病原體如沙門氏菌生長的條件。相反，許多腸桿菌和梭菌被認為是有害微生物，它們要么是侵入性的，要么產(chǎn)生有毒代謝物。因此，雙歧桿菌和乳酸桿菌增加，腸桿菌和梭菌減少對宿主動物有益。本研究目的是：（1）通過在肉雞和蛋雞飼料中添加甘露寡糖或棕櫚粕，研究其降低肉雞盲腸腸炎沙門氏菌定植的可能性；（2）確定保護性微生物區(qū)系的主要菌群，評估這些微生物可選擇性使用的碳水化合物，以確定有利于種群的條件。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與日糧 以30周齡的產(chǎn)蛋雞作為試驗動物，沙門氏菌缺乏癥的確診方法是進行兩次糞便培養(yǎng)，然后在第2周再進行1次。隨后，在第4周也對沙門氏菌進行盲腸內容物的培養(yǎng)，并在第4周將其屠宰，收集盲腸內容物。試驗基礎日糧見表1，處理組在基礎日糧中分別添加2.5%的甘露寡糖或棕櫚粕。

表1 試驗日糧配方g/kg

1.2 沙門氏菌感染及盲腸內容物制備 腸炎沙門氏菌在37℃的腦心灌注肉湯中培養(yǎng)過夜，用蛋白胨生理鹽水稀釋肉湯培養(yǎng)物，其濃度約為5×104CFU/mL。將30只無致病菌的成熟蛋雞隨機分為3組，每組10只，單雞單籠飼養(yǎng)，共飼養(yǎng)4周。

1.3 試驗設計 試驗1：將在-70℃保存的含盲腸內容物的粉料、甘露寡糖+盲腸內容物、棕櫚粕+盲腸內容物粉料在厭氧箱內解凍。在無菌試管中使用預還原腦心灌注肉湯連續(xù)稀釋10倍。試驗2：在兩個獨立的試驗（1-1和1-2）中評估了盲腸內容物對腸炎沙門氏菌定植的影響。每個試驗選擇20只1日齡的雛雞，隨機分為4組，每組5只，放在不同的紙箱中。同一天每只雞口服0.2 mL 3種未稀釋的盲腸內容物飼料制劑。第4組以肉湯作為對照。禁食3 h后，給所有的雛雞飼喂對應飼料。24 h后，雛雞口服懸在蛋白胨生理鹽水中濃度約為5×104CFU/mL的腸炎沙門氏菌。參考Cowan和Steel（2003）的研究方法進行后續(xù)菌群分析。

1.4 統(tǒng)計分析 采用單因素方差分析和Tukey兩兩配對檢驗日糧中細菌計數(shù)的差異。在試驗1中，由于試驗準備的不均勻，方差分析不合適。采用Fisher精確檢驗法對沙門氏菌陽性/陰性禽類的百分率進行評估。所有分析均采用Minitab統(tǒng)計分析軟件，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 盲腸內容物微生物比較 由表2可知，盲腸內容物一式3份，結果共檢測到13種微生物，其中6種需氧菌、7種厭氧菌。對照組、甘露寡糖組和棕櫚粕組對總厭氧菌數(shù)量無顯著影響（P＞0.05），但棕櫚粕組較對照組和甘露寡糖組顯著提高了雙歧桿菌數(shù)量（P＜0.05）。甘露寡糖和棕櫚粕組真桿菌數(shù)量較對照組高，但無顯著差異（P＞0.05）。對照組較其他兩組有提高擬桿菌數(shù)量的趨勢（P=0.07）。甘露寡糖組較其他兩組顯著提高了腸球菌數(shù)量（P＜0.05）。

表2 盲腸內容物微生物比較lgCFu/mL

2.2 盲腸微生物 由表3可知，兩個試驗結果顯示分離到的腸炎沙門氏菌數(shù)量很低（lg 0.2 CFU/mL）。但在試驗1-2中，甘露寡糖+盲腸內容物組腸炎沙門氏菌最低。在試驗1-1和1-2中，對照組腸炎沙門氏菌均值為lg 2.5和lg 7.7 CFU/mL。與對照組相比，兩個試驗中添加了盲腸內容物均顯著提高了厭氧菌數(shù)量（P＜0.05），同時顯著降低腸炎沙門氏菌數(shù)量（P＜0.05）。此外，試驗1-1和1-2中甘露寡糖+內容物、棕櫚粕+內容物均顯著降低了兼性厭氧菌和大腸桿菌數(shù)量（P＜0.05）。兩個試驗中只有棕櫚粕+內容物組較其他組顯著降低了腸球菌數(shù)量（P＜0.05）。

表3 盲腸內容物對肉雞盲腸微生物的影響lgCFu/mL

表4 甘露寡糖對盲腸腸炎沙門氏菌定植的影響

由表4可知，對照組降低了整個4周試驗期雞只感染數(shù)量，但甘露寡糖組僅在第4周降低了感染雞只數(shù)量。在第4周時，甘露寡糖組有2/5（40%）雞只發(fā)生感染（P＞0.05），但棕櫚粕組無雞只感染（P＜0.05）。

由表5可知，棕櫚粕組在第4周時盲腸厭氧菌、雙歧桿菌、乳酸菌和兼性厭氧菌數(shù)量顯著高于第2周（P＜0.05），但顯著降低擬桿菌數(shù)量（P＜0.05）。對照組和棕櫚粕組在第4周時均未檢測出腸炎沙門氏菌，同時對照組在第2和4周微生物數(shù)量無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

以果糖為基礎的低聚糖可以減少沙門氏菌定植，但與對照組相比，1和3周齡雛雞盲腸中的雙歧桿菌、擬桿菌、乳酸菌和大腸桿菌的數(shù)量影響很小（Fukata等，2015）。同樣的，Bailey等（2016）觀察到，在雞飼料中添加果寡糖可以刺激雙歧桿菌在盲腸中的生長，同時減少鼠傷寒沙門氏菌計數(shù)。本研究結果顯示，日糧添加棕櫚粕刺激了肉雞兼性厭氧菌的生長，尤其是雙歧桿菌和乳酸菌。在第4周同時降低了擬桿菌數(shù)量。Oyarzabal和Connor（1995）體外研究表明，沙門氏菌似乎無法代謝果寡糖等寡糖，而體內研究報告稱，日糧中的果寡糖對肉雞沙門氏菌定植的敏感性影響很小。

表5 棕櫚粕對第2和4周肉雞盲腸微生物的影響lgCFu/mL

本試驗研究也發(fā)現(xiàn)，日糧添加甘露寡糖或棕櫚粕刺激了厭氧菌的生長，尤其是雙歧桿菌和真桿菌。當雛雞服用含有盲腸內容物+甘露寡糖或棕櫚粕的飼料時厭氧菌數(shù)量增加，同時兼性厭氧菌（包括腸炎沙門氏菌和大腸桿菌）數(shù)量減少。但本研究表明，飼料添加盲腸內容物可減少雞腸炎沙門氏菌的定植，但添加甘露寡糖或棕櫚粕后更有效，這與Fernandez等（2000）的研究結果一致。許多雙歧桿菌菌株分泌殺菌或抑菌物質，影響沙門氏菌、彎曲桿菌和志賀氏桿菌微生物的生長，這說明產(chǎn)酸并不是雙歧桿菌唯一的抑制機制，這些抗菌物質也參與本試驗觀察到的變化。低聚糖在雛雞腸道下段有效時對沙門氏菌的抑制作用可能是因為低聚糖在結腸和盲腸中的發(fā)酵，通過產(chǎn)生低氧化還原電位，清除氧和產(chǎn)生有機酸抑制致病菌來調節(jié)腸道菌群。

4 結論

綜上所述，本研究證明添加甘露寡糖或棕櫚粕和盲腸內容物的兩種飼料對雞盲腸菌定植的有益影響，同時具有增加盲腸雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量，降低擬桿菌和腸桿菌數(shù)量的潛力。