慢性乙型肝炎與調節性T細胞研究進展*

杜科業，楊東亮，劉 嘉

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球最常見的傳染病之一，是嚴重影響人類健康的公共衛生問題。據世界衛生組織最新統計，全球約有2.57億慢性HBV感染者。慢性乙型肝炎病情反復遷延，可致肝纖維化，并逐步進展為肝硬化和肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[1]。對于慢性HBV感染，抗病毒治療可以有效控制病毒復制，改善絕大多數患者的臨床狀況，并降低死亡率和發病率。但現在的抗病毒藥物存在停藥后反彈等問題，大多數慢性乙型肝炎患者需要接受終生治療，較難實現慢性HBV感染的功能性治愈。特異性T細胞活化和應答在清除HBV肝內感染方面發揮著關鍵作用[2]。急性自限性HBV感染患者體內通常可檢出針對多個HBV表位的特異性CD8+T細胞，去除HBV急性感染黑猩猩體內CD8+T，則HBV難以被清除而導致感染持續；在慢性HBV感染患者體內，CD8+T細胞應答缺失或減弱，處于功能性耗竭狀態[3]。調節性 T細胞（regulatory T cell，Treg）是 CD4+T細胞中的一種特殊亞群，可以抑制或者下調效應性T細胞的功能和增殖，從而維持免疫耐受狀態或抑制自發性免疫的產生[4]。Treg細胞在效應性T細胞功能損傷及建立慢性HBV感染中發揮著重要作用。本文就Treg細胞的發現、分類及其在HBV感染過程中發揮的作用加以介紹。

1 Treg細胞的發現

Gershon及其同事在上世紀70年代就提出了“T細胞介導免疫抑制”的概念[5]，但直到80年代，才在小鼠和大鼠的自身免疫性疾病模型中發現了一群特殊的T細胞亞群，這群細胞在阻止自身免疫發生中發揮著重要作用[6]。然而，由于缺乏特異性的細胞標志物，關于這群特殊的T細胞亞群的研究推進受到了影響。90年代，Sakaguchi et al在將敲除了CD4+CD25+的T細胞過繼轉輸到裸鼠體內后誘發了自身免疫性疾病的發生[7]。相反地，重新補充CD4+CD25+T細胞可以有效抑制自身免疫性疾病的發生和發展。最終，這群結構性表達白細胞介素 2（interleukin-2，IL-2）受體 CD25分子的 T細胞亞群被命名為“Treg”。不久后，相似的結果在人體實驗中也得到了證實[8]。

但值得注意的是，Treg很難十分有效地與效應T細胞進行區分，這是由于效應T細胞同樣可以表達CD4和CD25，甚至在CD25高表達的T細胞群中依然包含有50%剛活化的T細胞。因此，CD4和CD25兩種標志物并不足以將Treg從常規T細胞中區分出來，特別是與效應T細胞相區分。隨著對Treg研究的深入，FoxP3被進一步證實為決定CD4+CD25+Treg細胞表型及功能的主要調節分子[9]，研究表明當FoxP3的表達受損或者下調時，Treg抑制性功能也會受到影響，逆轉FoxP3的表達后這群細胞會重新獲得調節性功能。目前，Treg被認為主要從初始 CD4+T細胞分化而來，CD4、CD25和FoxP3是其最主要的標志物[10]。

2 Treg細胞亞群

根據發育機制的不同，目前Treg主要分為兩個亞群：即自然調節性 T細胞（natural Treg，nTreg）和誘導型調節性T細胞（inducible Treg，iTreg）。nTreg來源于胸腺細胞，在胸腺內分化、發育、成熟，而iTreg可由外周初始T細胞分化而來，或在持續小劑量的抗原刺激下由已分化的T細胞發展而來[11]。

2.1 nTreg nTreg作為CD4+T細胞的一個重要亞群，在胸腺中發育，并可以從胸腺釋放至外周血中發揮作用，遷移出胸腺的nTreg約占正常人或小鼠外周CD4+T細胞的5%～10%[12]。 但nTreg發育并獲取抑制能力所需的信號依然還不清楚，在TCR轉基因小鼠的研究中，人們發現，胸腺中的Treg發育需要高親和力TCR刺激并依賴于B7分子的共刺激信號[13]。nTreg構成獨特的胸腺來源的T細胞譜系，其具有抑制抗原呈遞細胞（APC）活化和功能的能力，如樹突細胞（DC）、單核細胞和B細胞以及效應T細胞[14]。在外周循環中nTreg主要表達CD25、Foxp3、CCR4、PD-1 和低水平的 CD127，并且它們通過分泌IL-10、IL-35、TGF-β發揮負向調控作用。其中Foxp3被認為是小鼠和人類中Treg的最特異性標記物[15]。

2.2 iTreg iTreg細胞在生理應激或疾病狀況下可在胸腺外發育，并在胸腺外通過炎癥和疾病過程的誘導獲得CD25的表達，如自身免疫性疾病或癌癥。 iTreg細胞頻率和功能特性很重要，因為iTreg數量的增加可能有利于慢性感染的建立[16]。iTreg和nTreg具有相似的功能，nTreg細胞與iTreg細胞在維持耐受性方面的貢獻尚不清楚，但兩者都很重要。在nTreg和iTreg細胞之間觀察到表觀遺傳差異，前者具有更穩定的Foxp3表達和更廣泛的去甲基化。有研究顯示，CD39+iTreg細胞與CD39-iTreg細胞相比顯示出增強的增殖和抑制能力以及更低的炎性細胞因子表達[17]。Notch和TGF-β信號通路在iTreg分化中發揮著重要作用。已經觀察到，在HBV相關的肝損傷的不同階段，Notch信號傳導參與調節外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）和肝臟中 FoxP3+Treg。阻斷肝臟浸潤的淋巴細胞中的Notch信號傳導會顯著降低FoxP3的表達，強烈表明Notch信號影響FoxP3表達[18]。

在急性HBV感染時，Notch信號傳導上調，促進CD8+T細胞增殖活化產生IFN-γ。然而，在慢性HBV感染時，Notch信號分子的表達降低，但隨著乙型肝炎肝硬化和HCC的發展，Notch表達再次增加。在HBV感染的肝硬化患者Notch可誘導肝內淋巴細胞表達FoxP318。除Notch外，TGF-β信號傳導也有助于區分肝硬化和HCC患者iTregs與普通T細胞。同時，Notch信號傳導增強TGF-β功能[19]。

3 Treg免疫抑制機制

Treg發揮免疫抑制的機制目前依然不是很清楚，但有越來越多的證據表明Treg可通過多種機制發揮免疫調節功能，如分泌抑炎細胞因子IL-10和TGF-β[20]。此外，Treg表達糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）和細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白 4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4）等免疫共抑制分子，并可通過細胞接觸來發揮其抑制作用[21]。除上述機制外，IL-2受體CD25在Treg上的高表達導致Treg與效應T細胞競爭性結合IL-2，從而使效應T細胞處于“饑餓”狀態，抑制其增殖并最終導致效應T細胞凋亡。給予外源IL-2則可以消除Treg介導的增殖抑制作用[22]。然而，有研究表明，Treg抑制T細胞功能，IL-2的消耗并不是抑制增殖的原因，因為通過阻斷CD25并未在Treg的最佳刺激條件下消除抑制。值得注意的是，在次優刺激條件下，人類Treg需要CD25信號才能獲得抑制能力，Treg的IL-2消耗和對靶細胞的抑制可能僅在某些情況下起作用[23]。

IL-35是新近發現與Treg細胞介導的免疫抑制作用有關的細胞因子，可以直接抑制T細胞增殖[24]。IL-35表達缺陷的Treg在體外和體內的抑制能力均明顯降低。與小鼠Treg相反，人類Treg并不表達IL-35。盡管如此，IL-35依然可能在人體免疫抑制中發揮重要作用，因為用IL-35處理人或小鼠初始T細胞均誘導產生了所謂的iTR35調節群，該群體通過IL-35的介導發揮抑制作用，并且不需要IL-10或TGF-β的參與[25]。雖然人類幼稚Treg沒有大量表達IL-35，但長期刺激Treg可以導致IL-35表達上調。這些活化的Treg以IL-35依賴性方式發揮與非接觸依賴性的體外抑制作用，并且還誘導iTR35細胞的產生[26]。

4 Treg與HBV

HBV感染可以誘導Treg數量及在肝內浸潤增加。來自HBV感染小鼠模型的研究工作顯示，急性HBV感染過程中肝內Treg細胞數量顯著增多，但其增殖水平并未增加，提示Treg為趨化募集進入肝臟。進一步的表型分析顯示在此過程中Treg的表型并未出現明顯改變，但其仍然保留了抑制HBV特異性效應T細胞應答的能力[27，28]。敲除Treg可以導致肝內HBV特異性T細胞增強且病毒清除加速，但同時也會加重肝臟損傷，提示Treg在急性HBV感染過程中發揮調控效應T細胞應答強度和避免免疫損傷的生物學效應。在慢性HBV感染過程中，Treg的數量亦顯著增多。相比于健康人和自限性恢復的個體，在慢性乙型肝炎患者外周血單核細胞和肝內中有著更高頻率的CD4+CD25+Treg細胞，并與血清病毒載量呈正相關[29]。將Treg去除后，患者外周血單個核細胞針對HBsAg刺激產生IFN-γ的水平顯著增加。

慢性乙型肝炎患者體內Treg的數量也與是否接受抗病毒治療有關。有研究表明，核苷類似物治療可以顯著降低外周循環中Treg的比例，且這種降低伴隨著HBV特異性T細胞應答的增強，同時HBV DNA下降[30，31]。除核苷類似物外，聚乙二醇干擾素（peg-IFNα）治療同樣可以顯著減少慢性乙型肝炎患者外周循環中Treg細胞的數量。另外，Treg和Th17應答平衡是機體免疫功能變化的重要指標。研究顯示，與健康對照組相比，慢性乙型肝炎患者體內Th17細胞數量亦顯著增加，且IL-17水平也明顯增高，這部分CHB患者在經過Peg-IFNα治療后，Treg細胞、Th17細胞以及IL-17水平均明顯下降[32]。Treg/Th17比值還可用于預測核苷酸類似物治療CHB患者的應答狀況。研究顯示在替比夫定的治療過程中，Treg/Th17比值基線值越低，經治療后獲得HBeAg轉陰的幾率越大[33]。

Treg通過分泌IL-10和IL-35等抑炎細胞因子發揮免疫抑制效應。在乙型肝炎感染過程中可見IL-10表達水平升高，且IL-10水平與血清病毒滴度及肝臟炎癥程度密切相關[34]。在慢性HBV感染患者外周CD4+T細胞中可檢測到IL-35，而在健康個體中卻無法檢測到[35]。這些細胞因子可能通過抑制T細胞的增殖和效應功能，從而參與乙型肝炎免疫耐受的維持。新近研究還顯示，Treg可通過其表達的CTLA-4抑制濾泡輔助性T細胞（Tfh）的功能，從而導致其無法輔助B細胞功能成熟產生中和性抗體，導致HBV感染持續。若通過抗體阻斷CTLA-4的功能，則可恢復Tfh和B細胞的活化，介導病毒的清除[36]。

5 總結

抗病毒免疫應答的發生和強度受到免疫系統復雜調控網絡的嚴密調控。在慢性HBV感染過程中，病毒利用機體的免疫負調機制如免疫檢查點分子和Treg等來抑制抗病毒特異性免疫應答，誘導針對病毒的免疫耐受。設計針對這些免疫負向調控因子的靶向治療手段，有望重建CHB患者體內的HBV特異性抗病毒免疫應答，從而使患者能夠依靠自身免疫系統而非核苷類似物等抗病毒藥物實現對HBV感染的持續性免疫控制，達到功能性甚至是徹底治愈的狀態。同時，我們必須看到Treg等免疫負調因素在維持機體免疫自穩狀態中的重要作用，設計相應免疫治療策略時需慎重和權衡利弊。因此，仍需進一步深入闡明HBV感染過程中Treg發揮的生物學作用及其相關的細胞和分子機制。