利用條件反射箱檢測血管性認知障礙大鼠的執行功能

楊宇琦，楊凌宇，吳曉莉，厲含之，陳予東，劉麗旭

(中國康復研究中心神經康復科，北京 100068)

血管性認知障礙(vascular cognitive impairment,VCI)包括與腦血管疾病相關或由腦血管疾病引起的輕至重度認知障礙，是腦血管病常見的并發癥[1]。隨著人口老齡化的進展，VCI逐漸加重家庭及社會的負擔。人口老齡化和老年人群中VCI的高發病率都將導致未來30年VCI患者數量將大幅增長[2]。既往研究強調認知功能障礙可能是腦血管病最早、最常見、最敏感的表現，并提出認知功能障礙可作為一種預后指標[3]。事實上，早期發現細微的認知減退并不容易，VCI在治療過程中不能停止或逆轉認知功能障礙，只能在減緩認知衰退進程的較晚階段被發現[4]。因此，本研究采用前期課題組發明的操作性條件反射箱對大鼠進行電擊刺激建立動物傷害性刺激的操作性條件反射，觀察VCI大鼠的行為學特征，同時通過觀察腦組織的超微結構，研究操作性條件反射箱對評估VCI大鼠執行功能的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

條件反射箱(專利號：ZL 200910084240.3，張通教授設計，上海吉量公司制造)：箱體外壁長×寬×高=37 cm×27 cm×45 cm，內壁長×寬×高=35 cm×25 cm×40 cm，箱體壁厚1 cm(銅棒中心到頂板/攝像頭的高度為32 cm)；DigBehv 動物行為分析系統(上海吉量軟件公司)；Morris水迷宮儀(上海吉量公司)。成年Sprague-Dawley 大鼠(n=50,雌雄各半，體重260～280 g)購自中國軍事醫學科學院實驗動物中心，動物合格證號：SCXK-(軍)2002-001。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物建立反射及分組 50只SD大鼠飼養于清潔級動物房內，室溫22～26 ℃，標準12 h光/暗循環晝夜交替，固定飼料喂養，自由飲食。觀察動物精神活潑、反應靈敏、體形正常、毛色光澤者可納入實驗。將大鼠放入條件反射箱中，熟悉環境1 min，1 min后箱底通電，反射箱底通電后，設定電壓為35 V，刺激時間為10 min。觀察到大鼠自發畏縮、豎毛、舉尾、并隨電壓增加出現跳躍甚至嘶叫等，在箱內無目地跑動，會多次無意踩踏板裝置而中斷電流解除電流刺激，反復多次后，大鼠學習到如何避免傷害性刺激。以壓操縱桿時間超過刺激時間的90%為建立反射成功。對大鼠進行持續4 d的條件反射，在操作中盡量保證大鼠不受到驚嚇與注意力的轉移。最后，選取建立操作性條件反射成功大鼠45只，隨機分為模型組15只，假手術組15只，空白對照組15只。

1.2.2 實驗動物大腦中動脈缺血再灌注損傷模型制備 采用線栓法對模型組進行大腦中動脈(middle cerebral artery,MCA)缺血再灌注手術，該模型均對左側進行栓塞，以大鼠出現呼吸、心跳加快，甚至出現尿失禁，即為MCA起始處栓塞成功[5]。栓塞后縫合，缺血2 h拉出線栓灌注。假手術組同上，但栓線只到頸外動脈和頸內動脈的分叉處。術后觀察大鼠行為變化，無異常后繼續飼養,自由飲食。

1.2.3 實驗動物執行功能測定 將手術干預后的3組實驗動物在術后48 h放入條件反射箱，施以35 V電壓和10 min刺激時間的電擊，觀察壓桿的時間、活動的軌跡和路程，并通過視頻觀察活動情況。

1.2.4 實驗動物Morris水迷宮檢測 對各組大鼠進行Morris水迷宮檢測，觀察各組大鼠的行為學改變，通過空間探索試驗和定位航行試驗來進行[6]。訓練共6 d，上午及下午各訓練4次，定位航行試驗中觀察大鼠2 min內找到平臺的時間，記錄逃避潛伏期，定位航行試驗結束后撤除平臺，進行空間探索試驗。任選一個相同入水點將各組大鼠分別放入水中，在2 min內觀察并記錄大鼠跨越原平臺象限的次數。比較各組大鼠的逃避潛伏期和跨越次數，若模型組與其他兩組之間存在差異，則提示該模型造模成功[7]。

1.2.5 觀察各組大鼠感覺運動皮層的超微結構 參照Woolsey的新皮層機能分區法和神經系統解剖圖取左側運動感覺皮層處直徑1 mm的組織塊制作電鏡標本：2%多聚甲醛、2%戊二醛溶液中固定2 h，經0.l mol磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)沖洗，再經1%四氧化鋨酸固定2 h，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，梯度乙醇脫水，Epon812環氧樹脂包埋，制備超薄切片，經醋酸雙氧-枸櫞酸鉛染色。每份標本制作3張銅網。PhihPsCMor透射電鏡(首都醫科大學神經科學研究所)檢測標本，觀察運動感覺皮層的神經病理變化，AGFA數碼相機拍照，定性分析標本病理學變化。

1.3 統計學分析

用SPSS 25.0統計軟件處理數據，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮檢測結果

假手術組與對照組的平均逃避潛伏期、跨越次數比較，差異無統計學意義(t=1.944、0.346，P=0.062、0.732)。模型組的平均逃避潛伏期均大于假手術組和對照組(t=28.488、22.490，P<0.001)，而平均跨越次數均少于假手術組和對照組(t=15.255、9.475,P<0.001)，提示該模型造模成功。見表1。

2.2 各組大鼠在操作性條件反射箱中的測試結果

在反射箱中，假手術組與對照組的平均壓桿時間、路程相比較，差異無統計學意義(P>0.05)。模型組的壓桿時間均低于假手術組和對照組，而活動路程參數均高于假手術組和對照組，差異具有統計學意義(P<0.001)。見表2。

表1 各組大鼠平均逃避潛伏期、跨越次數的檢測結果

*P<0.001，與假手術組比較；#P<0.001，與對照組比較。

表2 各組大鼠操作性條件反射箱測試結果

*P<0.001，與假手術組比較；#P<0.001，與對照組比較。

2.3 大鼠腦組織超微結構的變化

經電鏡觀察發現，模型組運動感覺皮層發生了神經細胞固縮、破裂，胞核固縮移位，新生突觸形成，髓鞘疏松等一系列病理變化，而假手術組及對照組則無上述變化。見圖1。

3 討論

絕大多數急性腦卒中病例是因供血動脈血管閉塞引起的，而由血管破裂伴相關出血引起的急性腦卒中只占少數，約15%。局灶性腦缺血所導致的腦損傷的程度取決于許多因素，例如缺血的嚴重程度、持續時間或者重要的側支血流量[8]。VCI發病率逐年上升，然而它的發病機制尚不明確，臨床治療上仍缺乏明確、高效的藥物和治療方法。因此，VCI 動物模型的有效建立和認知功能的成功檢測對研究VCI的發病機制、藥物治療有著重要意義。目前，嚙齒類動物在VCI模型中應用最為廣泛，本研究選用了近年來國內外常用的一種大腦中動脈缺血再灌注損傷法來制作VCI 動物模型[9-10]。同時，采用已有30多年研究歷史的Morris水迷宮來客觀評價VCI動物的學習記憶功能，該方法是研究動物海馬損害后的空間學習記憶能力變化的行為學方法，也是評價VCI動物模型認知功能障礙的最重要行為學方法[11-12]。

Morris水迷宮主要檢測的是記憶力及空間學習能力，通過行為學改變來體現。然而，水迷宮缺乏對執行功能的檢測，對實驗室的條件和實驗動物的體力要求比較高，老年大鼠及造模手術后大鼠完成檢測較困難。因此，本研究應用Morris水迷宮檢測VCI大鼠造模成功，模型組的平均逃避潛伏期均大于假手術組和對照組，而平均跨越次數均少于假手術組和對照組(P<0.05)。采用前期課題組發明的能使大鼠形成穩定條件反射且能檢測局灶性缺血大鼠淺感覺障礙的操作性條件反射箱來檢測VCI大鼠的執行功能，結果發現，模型組在反射箱中的壓桿時間均低于假手術組和對照組，而活動路程參數均高于假手術組和對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，提示該試驗裝置能夠檢測VCI大鼠的執行功能。

以往大量研究[13-14]表明，有關VCI的主要致病機制包括了炎癥、氧化應激、突觸結構和功能異常、中樞膽堿能及單胺能系統神經遞質功能紊亂、能量代謝障礙等，同時也描述了缺血再灌注后腦組織的形態學變化。然而，目前針對腦內超微結構的研究及觀察鮮有報道，本研究通過透射電子顯微鏡發現模型組運動感覺皮層的一系列病理變化，如：神經細胞固縮、破裂，胞核固縮移位，新生突觸形成，髓鞘疏松等，而假手術組及對照組則無上述變化，這些發現在一定程度上也驗證了行為學檢測的結果。總之，本研究發現操作性條件反射箱能評估VCI大鼠的執行功能，為VCI的早期發現和治療提供一定的理論依據。