PMS2、C-met及MSH6聯合檢測在結腸息肉與結腸癌中的意義

杜錦波，劉明發，李梅嶺，劉杰，朱春景

(滄州市人民醫院，1.胃腸(微創)外科；2.內分泌科，河北 滄州 061000)

近些年，伴隨人們的生活條件及習慣的改變，結直腸癌發病率逐年升高，已成為男性第3位、女性第2位的高發腫瘤，且發病人群逐漸年輕化[1-2]。結腸位于腹腔，有著較為豐富的淋巴系統，血液系統和比鄰器官(肝臟、胰腺、胃、脾臟、輸尿管、膀胱等)。這些特點導致結腸癌的惡性程度比較高，容易局部侵犯，使得結腸癌的規范的外科治療成為難點。結腸息肉是一種常見的結腸疾病，息肉來源于粘膜上皮。隨著結腸鏡在各大醫院的廣泛應用，結腸息肉受到更多的重視，特別是絨毛狀腺瘤，家族性息肉病被更多的學者認為更易發生癌變[3]。隨訪研究結果顯示，結腸息肉的整體惡變率為10%，一般需要10年左右時間，尤其是腺瘤性息肉，腺瘤愈大，絨毛越多，癌變率愈高。目前，關于大腸息肉發生癌變的具體機制尚不清楚。本研究選取結腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、家族性息肉病、結腸癌標本分別檢測PMS2、C-met、MSH6的表達，以探索其在結腸息肉癌變中所起的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集滄州市人民醫院胃腸微創外科2010年1月至2012年8月住院病例病理標本。其中，結腸管狀腺瘤42例，絨毛狀腺瘤41例，家族性息肉病40例，結腸癌42例。標本均使用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋并且制成切片備用。

試劑與儀器 ：兔抗人MSH6 PMS2 C-met的抗體購于武漢博士德公司。SP免疫組化二步法檢測試劑盒、抗原修復液，DAB顯色液、PBS緩沖液均購自北京邁新生物技術有限公司。免疫組化主要儀器有顯微鏡、切片機，組織脫水機、孵育盒等。

1.2 方法

本研究所需切片均脫蠟水化；3%H2O2室溫孵育10 min； 蒸餾水2次沖洗，PBS浸泡6 min；再行抗原修復；10% 正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，分別滴加(1∶100) 的PMS2、C-met、MSH6的單克隆抗體、4 ℃過夜；PBS沖洗3次，每次5 min；生物素標記二抗工作液37 ℃孵育30 min；PBS沖洗3次，每次5 min； 滴加2滴辣根酶標記鏈霉卵白素37 ℃ 孵育30 min；PBS 沖洗3次，DAB顯色劑顯色；自來水充分沖洗，封片。每例染2張。在光學顯微鏡5個高倍視野下觀察，分析。進行視野內陽性細胞計數，并計算陽性細胞所占比例。腫瘤細胞無著色為(-)；<25%的細胞著色(+)；25%～50%的細胞著色為(++)；>50%的細胞著色為(+++)。

1.3 統計學分析

采用SAS9.2統計軟件對數據進行分析處理，計數資料以百分率(%)表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PMS2在結腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、家族性息肉病、結腸癌中的表達

PMS2主要表達于細胞核，且在結腸癌中的表達明顯低于家族性息肉病(P<0.05)，在家族性息肉病中的表達明顯低于結腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤(P<0.05)。見圖1和表 1。

表1 PMS2在結腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、家族性息肉病、結腸癌中的表達

項目陰性陽性表達率(%)結腸管狀腺瘤(n=42)33992.6絨毛狀腺瘤(n=41)53687.8家族性息肉病(n=40)122870.0#結腸癌(n=42)231945.2?

*P<0.05，與家族性息肉病相比；#P<0.05，與結腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤相比。

2.2 C-met在結腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、家族性息肉病、結腸癌中的表達

C-met的表達以細胞漿為主，呈棕黃色或棕褐色為陽性染色。且在結腸癌中的表達明顯高于家族性息肉病(P<0.05)，在家族性息肉病中的表達明顯高于結腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤(P<0.05)。見圖2和表 2。

表2 C-met在結腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、家族性息肉病、結腸癌中的表達

項目陰性陽性表達率(%)結腸管狀腺瘤(n=42)311126.2絨毛狀腺瘤(n=41)281331.7家族性息肉病(n=40)221845.0#結腸癌(n=42)123071.4?

*P<0.05，與家族性息肉病相比；#P<0.05，與結腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤相比。

2.3 MSH6在結腸管狀腺瘤，絨毛狀腺瘤，家族性息肉病，結腸癌中的表達

MSH6主要表達于細胞核，部分在胞質中表達，且染色呈棕黃色。且在結腸癌中的表達明顯低于家族性息肉病(P<0.05)，在家族性息肉病中的表達明顯低于結腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤。差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3和表 3。

表3 MSH6在結腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、家族性息肉病、結腸癌中的表達

項目陰性陽性表達率(%)結腸管狀腺瘤(n=42)43890.5絨毛狀腺瘤(n=41)83380.5家族性息肉病(n=40)172357.5#結腸癌(n=42)311126.2?

*P<0.05，與家族性息肉病相比；#P<0.05，與結腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤相比。

2.4 MSH6表達與PMS2、C-met的相關性

MSH6的表達與C-met表達呈負相關性，與PMS2的表達呈正相關性，且均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 MSH6表達與PMS2、C-met的相關性

3 討論

在實際臨床工作中以結腸鏡來發現結腸息肉，當結腸息肉發展為惡性腫瘤時又以結腸癌的TNM分期，有無脈管癌栓，有無神經侵犯等因素來預測結腸癌患者的預后。但是經常遇到相同TNM分期的結腸癌患者，預后卻不完全相同[4]。有些TNM分期較早的患者卻很早的出現了遠處轉移，導致預后很差。結腸均位于腹腔，按照解剖學可分為升結腸，橫結腸，降結腸，乙狀結腸。按照血管供應則分為右半結腸，左半結腸。結腸的主要功能為吸收水分，形成和傳輸大便。結腸的血液供應主要來自于腹主動脈的分支腸系膜上動脈及腸系膜下動脈。結腸的淋巴系統非常豐富，非常容易淋巴轉移，并且有重要的大血管，使得結腸癌的淋巴清掃成為難點。結腸周圍有著較多重要的毗鄰器官(肝臟、胃、胰腺、小腸、脾臟、輸尿管等)，使得結腸癌容易造成局部侵犯導致手術無法完整切除。以上這些結腸癌的臨床特點使得結腸癌的外科手術治療成為難點。近些年結腸鏡的大量應用使得結腸癌能夠早期發現，其預后也有所改善。結腸癌很多是由結腸息肉發生，發展演變而來。結腸息肉直徑越大，個數越多，分布越密集，絨毛越多，越容易發生癌變。家族性息肉病幾乎都會發展為結腸癌，故家族性息肉病也成為了外科手術的適應癥。然而哪些息肉容易惡變，哪些息肉是外科手術的適應癥，尚無明確共識，所以有必要對結腸息肉和結腸癌的關系，相互發生發展的機制進行深入的研究，以便盡可能提供結腸癌的更全面的預防、篩查等的理論實驗依據，有助于結腸癌患者的二級預防。錯配修復系統(Mismatch Repair，MMR) 是正常人體重要的修復方式，這一系統廣泛的存在于自然界的所有生物體內，是人類不可缺少的重要修復方式。在正常的人體內，所有組織及細胞每時每刻都在有條不紊的進行著基因的重組和復制，在這一持續的過程中不可避免地會出現堿基的錯配及基因重組的錯配。這一錯配的發生使得正常人體無法進行有序的新陳代謝。MMR的作用就在于及時檢測發現并且能夠糾正使已經發生錯配的基因序列能夠恢復到正常的堿基配對。這一作用能夠有效維持正常人體內遺傳物質傳遞的穩定性和準確性。MMR這一修復系統幾乎存在于自然界的所有正常生物體內，其主要的作用是對人體核苷酸復制、重組過程中不可避免產生的錯誤進行有效監測并及時修復。MMR修復系統的作用不僅可以有效檢測遺傳物質的復制是否正確而且還可以及時的糾正遺傳物質在重組和復制過程中不可避免產生的錯誤。這一作用能夠有效地保持了遺傳物質復制重組過程中的正確性以及核苷酸序列的穩定性。在正常的人體內MMR這一修復系統具有重要的作用，然而這一修復系統一旦發生自身的突變，將會直接影響基因的監測，以及對已經發生的錯誤進行修正。這一修復系統的失效便會直接導致正常人體內的DNA產生微衛星不穩定(microsatellite instability MSI)以及正常人體內的遺傳物質在復制和重組過程中出現錯誤。 MSI的作用結果還表現為正常人體內致癌基因的過度激活與抑癌基因抑制，這一作用使得正常人體內致癌基因與抑癌基因這一互相平衡制約的基因被打破。這樣在我們正常人體細胞中的基因物質的突變頻率便會有所增加，這一作用的結果將直接導致人體正常的細胞發展為惡性腫瘤的可能性有所增加[5-6]。MMR修復系統的失效將可能成為正常人體細胞突變為惡性腫瘤的機制之一。

惡性腫瘤的發生，發展是由機體自身及外界多種因素共同作用的結果，結直腸癌的發生，發展同樣也是自身DNA受損后由于修復機制出現異常，最終引起DNA突變而導致癌變[7]。機體在正常情況下存在一套完整的DNA修復系統，包括錯配修復、重組修復、直接修復、SOS 修復、切除修復[8-9]，這些修復系統可以保證DNA復制的準確進行。堿基配對錯誤作用于非重復 DNA，從而引起配對錯誤；堿基插入會使DNA的序列出現紊亂，從而引起微衛星的缺失或插入，進一步導致MSI[10]。MMR基因主要作用在于細胞復制后進行修復即對DNA錯配堿基進行修復，從而有預防基因變異以及維持DNA復制正確的作用[5-6]，如不能充分發揮MMR的作用將導致微衛星 DNA 不穩定甚至出現復制錯誤， 進而引起細胞增殖及分化異常， 這將成為腫瘤發生發展的基礎[11]。MSH6、PMS2基因屬于MMR，它的的突變是導致結直腸癌發病的主要原因[12]。本研究證實，結腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、家族性息肉病、結腸癌標本中的MSH6、PMS2的表達呈下降趨勢，且在結腸癌中的表達明顯低于家族性息肉，在家族性息肉病中的表達明顯低于絨毛狀腺瘤。

C-met(肝細胞生長因子受體)是由原癌基因編碼合成，為肝細胞生長因子受體，其重要的生物學活性之一為酪氨酸激酶活性，它的重要功能為細胞之間的信息傳導，并且能夠控制細胞骨架的重排，這樣對于細胞的增殖、分化，細胞的運動這些功能有著重要的推進作用。許多國內外大型機構研究已經表明C-met參與了機體多種惡性腫瘤的發生發展[13]。本研究表明，結腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、家族性息肉病、結腸癌標本中的C-met的表達呈逐漸增高趨勢，且在結腸癌中的表達明顯高于家族性息肉，在家族性息肉病中的表達明顯高于絨毛狀腺瘤。C-met的作用機制與PMS2及MSH6的作用機制恰恰相反，這三種蛋白對結腸癌發生發展的作用結果與它們對結腸癌的作用機理保持了相互一致性。C-met的表達越強往往預示結腸息肉患者更容易發生發展為結腸癌。C-met的高表達也預示結腸癌的發展迅速，預后較差。而PMS2與MSH6的低表達往往預示結腸息肉患者更容易發生發展為結腸癌。PMS2與MSH6的低表達也預示結腸癌的發展迅速，預后較差。MSH6在結腸癌中的表達與C-met的表達呈負相關；MSH6的表達與PMS2的表達呈正相關性。PMS2與MSH6均屬于錯配修復基因；錯配修復基因編碼合成的這兩種蛋白質對結腸癌的發生，發展具有相似的作用機制，PMS2、MSH6的高表達往往提示結腸息肉不容易發展為結腸癌。即使發展為結腸癌，也預示結腸癌的分期較早，無脈管癌栓，淋巴結轉移較少，預后較好。這兩種蛋白如果表達缺失則意味著結腸息肉更容易演變為結腸癌，且發展為癌后的預后也較差。PMS2、MSH6的表達具有正相關性，在結腸癌中的作用具有一致性。這一結果與它們的作用機理一致[12]，也說明它們之間的表達可能具有協同性或者相互促進作用。MSH6在結腸癌中的表達與C-met的表達呈負相關性。C-met在正常人體的器官、組織、細胞中表達低下。然而當這些正常組織發生，發展演變為惡性腫瘤組織時，由C-met基因編碼而成的蛋白質水平則會明顯升高，當C-met處于較高表達水平時，便可以通過旁分泌和自分泌等多種途徑來激活多種信號通路，從而刺激正常的組織、細胞發生，發展，最終演變為惡性腫瘤細胞。PMS2，MSH6與C-met在結腸正常組織和細胞中的作用機制完全不一樣，它們在結腸息肉與結腸癌中陽性表達意義也截然相反。本研究得出的結果與這三種蛋白的作用機制的理論保持了一致性。本研究還揭示了PMS2、MSH6與C-met這三種蛋白對結腸息肉發生發展為結腸癌的作用以及這三種蛋白相互之間的關系，對用更全面系統的指標來預測哪些結腸息肉患者更容易轉變為結腸癌有著重要的指導意義。

綜上所述，MSH6、PMS2、C-met可能是結直腸惡性腫瘤發生發展的基礎，了解三者在結腸息肉與結腸癌中的表達可為結腸息肉的危險度評估、預防、治療、隨診提供參考依據。