妊娠期糖尿病腸道菌群變化及臨床價值分析

鄭劉芳，劉清秀，李娟

(1.重慶市開州區人民醫院產科，重慶 405425；2.成都市婦女兒童中心醫院產科，四川 成都 610091)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠前糖代謝正常或有潛在糖耐量減退，但在妊娠期才出現或確診一種糖尿病，在糖尿病孕婦中占比較大，高達80%，可明顯增加先兆子癇、流產、早產、難產、巨大胎兒及畸形等妊娠不良結局發生率[1-2]。目前，國內大多數城市均開展了GDM篩查發現，GDM發生率日漸升高，娜仁其木格等[3]學者針對中國妊娠期糖尿病患病率進行Meta分析發現，不同地區妊娠期糖尿病患病率各不相同，以華北地區最高，約13%。但其發病機制仍不十分明確，可能與肥胖、遺傳、炎性及脂肪細胞因子等有關[4]。2007年，“人類微生物組計劃”被提出，隨后隨研究深入發現，腸道菌群與機體肥胖、炎癥調控及糖尿病等多種代謝性疾病密切相關[5-6]，但其與GDM之間關系的研究較少。本研究以100例妊娠期糖尿病患者、100名正常妊娠人群和100名健康體檢女性作為研究對象，探討妊娠期糖尿病腸道變化規律，并分析其臨床價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年1月至2018年6月于重慶市開州區人民醫院產科收治的妊娠期糖尿病患者100例作為糖尿病妊娠組。妊娠期糖尿病診斷標準參照2011年ADA指南[7]：孕24～28周清晨空腹口服75 g葡萄糖后檢測后續任一項達標即可，空腹血糖≥5.1 mmol /L，餐后1 h血糖≥10.0 mmol/L，餐后2 h血糖≥8.5 mmol /L；所有研究對象確診后均給予相應干預治療。排除：(1)既往妊娠期糖尿病病史；(2)孕前糖尿病、糖耐量異常、多囊卵巢綜合征及慢性腸道疾病確診史；(3)合并嚴重內科疾病者；(4)近1月內使用過抗生素或微生態調節劑等影響腸道微生態的藥物者。選取同期年齡、孕周、孕次及產次等一般資料與之匹配的100名正常妊娠人群和100名健康體檢女性作為正常妊娠組和對照組。本研究所有研究對象及家屬均簽署知情同意書，且通過本院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 入組但未給予任何治療之前，收集糖尿病妊娠組空腹外周血及糞便。(1)空腹外周血收集。抽取空腹外周血5 mL于黃色血清管中，1 h內送檢，3 000 rpm離心10 min，取上清進行血糖及胰島素檢測；(2)糞便標本收集。用滅菌棉簽取早上自然排出新鮮糞便30～50 g于糞便采集專用管中，并于30 min內送檢。正常妊娠組和對照組糞便采集方法同上。

1.2.2 血糖相關指標檢測 本研究中血糖相關指標主要包括空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)和空腹胰島素(fasting insulin，FINS)。其中FBG采用美國雅培c1600全自動生化儀，FINS采用德國羅氏E160電化學發光分析儀。

1.2.3 腸道菌群檢測 (1)提取糞便DNA。采用糞便DNA提取試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司)進行檢測，具體步驟如下：取20 g糞便與1.4 mL GSL緩沖液混合后置于70 ℃溫浴5 min，后于震蕩儀上振蕩15 s，后以12 000 rpm離心1 min，棄上清，加入15 μL蛋白酶proteinase K和200 μL GB緩沖液，后70 ℃溫浴10 min，再加無水乙醇沉淀DNA，最后50 μL用TB洗脫緩沖液洗脫DNA過柱。(2)DNA質量檢測。采用NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測上述DNA濃度，當A260/A280比值為1.8～2.0即為合格，本研究所有DNA提取物均合格。(3)糞便細菌通用16SrDNA基因PCR擴增及文庫構建：采用糞便細菌通用16SrDNA V4區通用引物進行PCR擴增，后將PCR擴增產物純化后連接pGEM-T Easy Vector，后將連接產物電轉化至宿主菌，后將轉化子涂在SOB/氨芐青霉素平板上(含IPGT和X-Gal)，過夜培養，篩選陽性克隆送深圳華大基因公司進行測序。

1.2.4 觀察指標 收集糖尿病妊娠組FBG和FINS，并計算胰島素抵抗指數(insulin resistance,IR)=FBG×FINS/22.5；收集各組腸道菌群物種及優勢菌群，并計算其比例；收集各組妊娠不良結局情況，包括先兆子癇、流產、早產、難產、巨大胎兒及胎兒器官發育異常等。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組腸道菌群中優勢菌群比例比較

本研究共鑒定出9門屬腸道內細菌，各組均以厚壁菌門、擬桿菌菌門、變形菌門和放線菌門為主，3組腸道菌群種各優勢菌門屬比例比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 血糖相關指標與腸道菌群優勢菌門屬的關系

經Spearman相關分析，FBG、FINS和IR與厚壁菌門和放線菌門均呈明顯正相關(P<0.05)，而FBG、FINS和IR與擬桿菌菌門和變形菌門呈明顯負相關(P<0.05)。見表2。

2.3 各組妊娠不良結局情況比較

與正常妊娠組比較，糖尿病妊娠組妊娠不良結局總發生率明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表1 3組腸道菌群優勢菌群比例比較

*P<0.05，與對照組相比；#P<0.05，與正常妊娠組相比。

表2 血糖相關指標與腸道菌群優勢菌門屬的關系

表3 3組妊娠不良結局情況比較[n(%)]

2.4 妊娠不良結局與腸道菌群優勢菌門屬的關系

與正常妊娠結局組比較，不良結局發生組腸道菌群中厚壁菌門和放線菌門比例明顯升高，而擬桿菌菌門、變形菌門和其它菌門比例則明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 妊娠不良結局與腸道菌群優勢菌門屬的關系

3 討論

妊娠期女性激素、免疫、代謝等均可發生一系列變化，包括體重增加、血糖、瘦素、胰島素及膽固醇等水平增高，甚至出現嚴重胰島素抵抗，最終導致GDM發生[8-9]。 腸道菌群是指寄居在人體胃腸道內，從出生即開始建立形成，并隨著生長發育而不斷完善的正常菌群；至今為止，共發現1014個微生物，是人體細胞總數的10倍，以厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門、疣微菌門和梭桿菌門等6種優勢菌群為代表[10-11]。研究發現，腸道菌群可產生短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFA)、維生素B及維生素K等營養物質，與機體代謝、能量平衡及免疫調節等密切相關[12]。有學者發現，SCFA可調控胰島β細胞分泌抗菌肽分泌，提示腸道菌群可通過直接影響胰島免疫環境直接參與糖尿病的發生[13]。但關于妊娠期糖尿病腸道菌群變化及臨床價值探討較少。

在本研究中，共檢出9門屬腸道內細菌，其中厚壁菌門、擬桿菌菌門、變形菌門和放線菌門構成比例達90%以上，與前述結論基本一致，提示腸道菌群穩定性好，妊娠并未造成腸道菌群結構類型紊亂。 糖尿病妊娠組、正常妊娠組和對照組各優勢菌門屬比例比較差異明顯，提示腸道菌群對妊娠期糖尿病有一定診斷價值。其中正常妊娠組和對照組各優勢菌門屬比例比較，差異亦有統計學意義(P<0.05)，這是因為妊娠期代謝機能發生變化，腸道菌群構成及比例也隨之改變[14]。正常妊娠組和糖尿病妊娠組比較，厚壁菌門和放線菌門比例升高明顯，而擬桿菌菌門等其它菌門相對下降，其中尤以厚壁菌門比例變化明顯，這可能是因為厚壁菌門可發酵膳食纖維產生許多SCFA，通過調節胃腸道激素分泌、胰島素敏感性及糖脂代謝等參與糖尿病發生[15]；而擬桿菌菌門和變形菌門比例下降，其所抑制的TNF-α和IL-6等炎癥因子則明顯上升，使機體處于低炎癥水平，可誘發GDM發生[16]。此外，本研究經Spearman相關分析發現，血糖相關指標FBG、FINS和IR與厚壁菌門和放線菌門均呈明顯正相關，而FBG、FINS和IR與擬桿菌菌門和變形菌門呈明顯負相關，與上述觀點基本一致。在本研究中，妊娠期糖尿病患者妊娠不良結局發生率約15%，明顯高于正常妊娠者，說明妊娠期糖尿病在一定程度上可增加妊娠不良結局發生率，與國內外結論一致。而本研究主要比較了妊娠不良結局女性與正常妊娠結局女性腸道菌群發現，與正常妊娠結局組比較，不良結局發生組腸道菌群中厚壁菌門和放線菌門比例明顯升高，而擬桿菌菌門、變形菌門和其它菌門比例則明顯下降，提示腸道菌群變化在妊娠期糖尿病發生中占有一定地位，其中厚壁菌門和放線菌比例升高可增加妊娠期糖尿病發生概率，為臨床工作者預測妊娠期糖尿病患者妊娠結局提供參考。

綜上認為，與正常妊娠女性比較，妊娠期糖尿病患者腸道菌群結構及比例改變明顯，對其診斷及妊娠不良結局預測有一定價值。樣本量及樣本收集范圍是本研究限制點，后續將擴大樣本量及收集范圍，進一步完善結論。