山東省葡萄主要病毒病的分布及病原鑒定

吳斌 徐德坤 姜珊珊 張眉 王升吉 馬永利 辛志梅

摘要：葡萄病毒病嚴重影響葡萄的產量和品質，是制約葡萄產業發展的重要因素。為明確該病害在山東省的最新分布狀況及病原種類，2016—2018年采用田間調查結合RT-PCR檢測等方法對山東省葡萄主要病毒病進行了研究。結果表明，186份樣品中共檢出GLRaV-1、GLRaV-3、GRSPaV、GFLV、GFkV 5種病毒，檢出率分別為18.82%、9.68%、16.67%、1.61%、33.87%，且復合侵染發生普遍，檢出率為16.67%;樹齡較大的葡萄園以GLRaV-1、GLRaV-3病毒侵染為主，新建葡萄園以GRSPaV、GFkV病毒侵染為主。研究結果可為山東省葡萄病毒病的早期預防提供理論指導。

關鍵詞：山東省;葡萄病毒病;RT-PCR檢測;病原鑒定

中圖分類號：S432.4+1?文獻標識號：A?文章編號：1001-4942（2019）12-0073-05

Abstract?Virus diseases are important threats to the yield and quality of grape， restricting the development of grape industry. In the study， the methods such as RT-PCR and field investigation from 2016 to 2018 were used to investigate the distribution and pathogen species of virus disease in Shandong Province. The results showed that five viruses including GLRaV-1，GLRaV-3，GRSPaV，GFLV and GFkV were detected from 186 samples and the corresponding detection rates were 18.82%，9.68%，16.67%，1.61%，33.87%， respectively.The compound infection commonly occurred with the detection rate of 16.67%. In the vineyards with large tree-age grape，GLRaV-1 and GLRaV-3 were the main viruses;and in the newly-built vineyards，GRSPaV and GFkV were the main pathogen species. The results provided a theoretic guide for the early prevention against grape virus disease in Shandong Province.

Keywords?Shandong Province; Grape virus disease; RT-PCR detection; Pathogen identification

葡萄（Vitis vinifera L.）作為一類重要的經濟作物，在我國果樹生產中具有舉足輕重的地位，種植面積和產量均居世界第二位[1]，同時也是感染病毒病最多的果樹之一，該類病害的發生嚴重影響葡萄的產量和品質，是制約葡萄產業發展的重要因素[2]。目前，國內外已報道的葡萄病毒病病原種類達66種[3]，中國至今僅報道其中13種，包括葡萄卷葉相關病毒1～5、7（grapevine leafroll-associated virus，GLRaV-1～5，7）、沙地葡萄莖痘相關病毒（grapevine rupestris stem pitting-associated virus，GRSPaV）、葡萄扇葉病毒（grapevine fanleaf virus，GFLV）、葡萄斑點病毒（grapevine fleck virus，GFkV）、葡萄A病毒（grapevine virus A，GVA）、葡萄B病毒（grapevine virus B，GVB）、葡萄E病毒（grapevine virus E，GVE）和灰比諾葡萄病毒（grapevine pinot gris virus，GPGV）等[4-6]。其中，分布較廣、危害較重的有GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-4、GFkV、GFLV和GPGV，而病毒的復合侵染會加重對葡萄的危害[7]。

山東省是葡萄種植大省，常年種植面積在4.32×104 ?hm2左右，居全國第三位。近年來葡萄產業迅猛發展，栽培面積不斷擴大，苗木引種日益頻繁，但由于缺乏完善的病毒病檢測規范，山東省各地葡萄病毒病發生普遍，尤其是新建果園，嚴重地塊病株率高達60%以上，嚴重影響了經濟效益。對于山東省葡萄病毒病的系統研究較少，潘志勇等[8]發現GFLV和GLRaV是山東省葡萄產區主要病毒病，尚佑芬[9]、王升吉[10]等對山東省GRSPaV、GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3病毒進行了檢測，周瑩等[11]對膠東半島地區葡萄病毒病進行了普查，發現主要病原為GFkV、GLRaV-1和GLRaV-3。本研究于2016—2018年采集山東省葡萄主產區病毒病疑似樣品，基于田間調查與分子生物學檢測方法，明確了山東省葡萄病毒病的最新分布、主要的病原種類及復合侵染類型，為山東省葡萄病毒病的早期預防奠定基礎。

1?材料與方法

1.1?材料

2016—2018年于山東省煙臺市、青島市、日照市、濰坊市、臨沂市、聊城市和德州市7個葡萄主產區采集具有花葉、褪綠、黃化、畸形、皺縮等疑似病毒病癥狀的葡萄葉片樣品共186份，將采集的樣品保存于-80℃冰箱，以未感病的健康葡萄葉片作為陰性對照。

主要試劑：TransZol Plant多糖植物總RNA提取試劑盒、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株（北京全式金生物技術有限公司）;2 × Es Taq Master Mix（Dye）（北京康為世紀生物科技有限公司）;HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（南京諾唯贊生物科技有限公司）;Plus DNA Extraction Kit（GeneMark公司）;DNA Marker、pMD18-T克隆載體、Solution Ⅰ（TaKaRa公司）;特異性引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;其他生化試劑及普通化學試劑均為進口或國產分析純。

主要儀器：AE224C自動內標電子分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）;MM400組織研磨儀（德國Retsch公司）;Mastercycler nexus PCR儀、Centrifuge 5430R離心機（德國Eppendorf公司）;JY300電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）;GelDoc-It 310 Imaging System凝膠成像系統（美國UVP公司）。

1.2?總RNA的提取及cDNA合成

稱取0.1 g葡萄葉片樣品，置于2 mL離心管中，加入滅菌鋼珠，液氮冷凍后迅速在組織研磨機上研磨至粉末狀，并按試劑盒說明書提取葉片總RNA，-80℃保存。

以提取的植物總RNA為模板，在0.2 mL的RNase-free離心管中依次加入模板RNA 6 μL，Random hexamers 1 μL，RNase-free ddH2O 2 μL，65℃變性10 min后立即冰上放置2 min，再加入2×RT Mix 10 μL，HiScript Ⅱ Enzyme Mix 2 μL，25℃ 5 min;50℃ 45 min;85℃ 5 min。合成的cDNA保存于-20℃備用。

1.3?PCR擴增

根據已報道的13種葡萄病毒病相關病毒序列設計特異性引物（表1），以cDNA為模板分別進行PCR擴增，擴增體系如下：cDNA 1 μL，2×Es Taq Master Mix 15 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O補足總體積至30 μL。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.4?PCR產物回收、測序及分析

參照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書回收目的片段，并與pMD18-T載體連接，轉化DH5α菌株，挑取陽性克隆，經菌落PCR驗證后，送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序結果與GenBank中的序列進行Blast比對，分析病毒種類。

2?結果與分析

2.1?葡萄病毒病發生情況及癥狀

對山東省煙臺市、青島市、日照市、濰坊市、臨沂市、聊城市和德州市7個葡萄主產區進行調查，發現田間葡萄病毒病發生普遍，病株率在10%～30%，嚴重的苗圃田病株率可達60%以上。感病植株主要表現為花葉、葉片脈間褪綠、斑點黃化、葉緣卷曲、葉片皺縮、畸形（圖1）。

2.2?山東省葡萄病毒病病原檢測

對采集的186份病毒病疑似樣品分別進行RNA提取和RT-PCR檢測，結果表明，僅GLRaV-1、GLRaV-3、GRSPaV、GFLV、GFkV 5種病毒被檢出（圖2），檢出率分別為18.82%、9.68%、16.67%、1.61%、33.87%（表2）。測序結果與GenBank中已報道的分離物序列一致性均在90%以上。

2.3?山東省葡萄病毒病分布情況

對山東省葡萄主產區采集的186份葡萄樣品檢測結果進行統計發現，不同地區間病毒病發生存在差異性，煙臺、青島平度、萊西、聊城東昌府和德州臨邑等樹齡較大的葡萄園以GLRaV-1、GLRaV-3病毒侵染為主，新建葡萄園以GRSPaV、GFkV病毒侵染為主。復合侵染現象普遍，檢出率為16.67%，復合侵染的組合方式有4種（表2）。

3?討論與結論

葡萄繁殖方式主要為扦插和嫁接等無性繁殖，樹體一旦感染病毒將終生帶毒，給防治帶來很大的困難[23]。近年來葡萄產業迅速發展，苗木流通日漸頻繁，但由于引種時缺乏完善的病毒檢測標準，大大增加了病毒感染幾率，同時粗放的栽培管理模式，加速了病毒的蔓延[24]。因此，葡萄病毒病的早期檢測工作不僅是無病毒苗木認證中的一項基礎工作，也是防控葡萄病毒病的根本保障。

山東作為葡萄種植大省，在葡萄病毒病的防控技術研究上還存在大量空白。本研究對山東省葡萄主產區的主要病毒病發生情況和病原種類展開了系統性的調查和檢測。結果表明，山東省葡萄主要病毒病為GLRaV-1、GLRaV-3、GRSPaV、GFLV和GFkV，以GFkV檢出率最高，GFLV僅在兩個區域檢出，檢出率僅為1.61%，各病毒的檢出率無明顯的區域性差異;煙臺、青島平度、萊西、聊城東昌府和德州臨邑等樹齡較大的葡萄園以GLRaV-1、GLRaV-3病毒為主，新建葡萄園以GRSPaV、GFkV病毒為主，這與潘志勇等[8]的研究結果不完全一致，表明近年來隨著頻繁引種，山東省新建葡萄園主要病毒病病原發生了顯著變化。

復合侵染是病毒感染植物的一種常見現象，本研究結果表明山東省葡萄病毒病復合侵染現象普遍，檢出率為16.67%，復合侵染的組合方式有4種，單個樣品中最多可檢出3種病毒。其中，GFkV參與3個類型的復合侵染，GRSPaV和GFkV的復合侵染比列最高，檢出率為7.53%。結合前期的研究結果發現，葡萄病毒病多與葡萄類病毒病混合發生，加重了對葡萄的危害，嚴重影響葡萄產量和品質[24]。

綜上所述，葡萄病毒病已成為制約山東省葡萄產業發展的一類重要病害。本研究明確了山東省葡萄主要病毒病的發生現狀，為山東地區葡萄的引種、病毒病的早期檢測及防治提供了技術支持與理論指導。

參?考?文?獻：

[1]?賀普超. 葡萄學[M]. 北京：中國農業出版社， 1999： 1-2.

[2]?王引權， 古勤生， 陳建軍， 等. 葡萄病毒病研究進展[J]. 果樹學報， 2004， 21（3）： 258-263.

[3]?Martelli G P. Directory of virus and virus-like diseases of the grapevine and their agents[J]. Journal of Plant Pathology， 2014， 96 （1）： 1-136.

[4]?范旭東， 張尊平， 任芳， 等. 我國灰比諾葡萄病毒分離物檢測及基因序列分析[J]. 植物病理學報， 2018， 48（4）： 466-473.

[5]?范旭東， 董雅鳳， 張尊平， 等. 葡萄病毒E分子檢測及基因序列分析[J]. 植物病理學報， 2014， 44（5）： 455-460.

[6]?范旭東， 董雅鳳， 張尊平， 等. 葡萄病毒分子檢測技術研究進展[J]. 園藝學報， 2014， 41（5）： 1009-1019.

[7]?任芳， 董雅鳳， 張尊平， 等. 葡萄病毒研究最新進展[J]. 園藝學報， 2014， 41（9）： 1777-1792.

[8]?潘志勇， 翟衡， 左方梅， 等. 山東葡萄產區主要病毒病發生危害調查[J]. 植物保護， 2002， 28（6）： 40-42.

[9]?尚佑芬， 王升吉， 趙玖華， 等. 山東省沙地葡萄莖痘相關病毒的檢測[J]. 果樹學報， 2009， 26（2）： 158-162.

[10]王升吉， 趙玖華， 尚佑芬， 等. 山東省葡萄幾種主要病毒病調查及檢測研究[J]. 北方園藝， 2011（7）： 20-23.

[11]周瑩， 林秀敏， 嚴紅， 等. 膠東半島地區葡萄病毒病田間調查和血清檢測[J]. 中國果樹， 2011（2）： 43-46， 51.

[12]Osman F， Rowhani A. Application of a spotting sample preparation technique for the detection of pathogens in woody plants by RT-PCR and real-time PCR （TaqMan）[J]. Journal of Virological Methods， 2006， 133（2）： 130-136.

[13]Nakaune R， Nakano M. Efficient methods for sample processing and cDNA synthesis by RT-PCR for the detection of grapevine viruses and viroids[J]. Journal of Virological Methods， 2006， 134（1/2）： 244-249.

[14]Osman F， Leutenegger C， Golino D， et al. Real-time RT-PCR （TaqMan） assays for the detection of grapevine leafroll associated viruses 1-5 and 9[J]. Journal of Virological Methods， 2007， 141（1）： 22-29.

[15]Good X，Monis J. Partial genome organization， identification of the coat protein gene， and detection of grapevine leafroll-associated virus-5[J]. Phytopathology， 2001， 91（3）： 274-281.

[16]Nie X， Singh R P. A novel usage of random primers for multiplex RT-PCR detection of virus and viroid in aphids， leaves， and tubers[J]. Journal of Virological Methods， 2001， 91（1）： 37-49.

[17]Engel E A， Eacobar P， Montt C， et al. First report on the occurrence of grapevine leafroll-associated virus 7 and 9 in Chilean grapevines[J]. Plant Disease， 2008， 92（8）： 1252-1253.

[18]De Meyer J， Gaudin M， Bourquin L， et al. New primers for the molecular identification and detection of grapevine virus A （GVA）[C]//Adelaide， Australia： Extended abstracts 13th meeting ICVG， 2000： 138-140.

[19]Minafra A， Saldarelli P， Grieco F， et al. Nucleotide sequence of the 3′ terminal region of the RNA of two filamentous grapevine viruses[J]. Arch. Virol.， 1994， 137（3/4）： 249-261.

[20]Nolasco G， Mansinho A， Teixeira Santos M T， et al. Large scale evaluation of primers for diagnosis of rupestris stems pitting associated virus-1[J]. European Journal of Plant Pathology， 2000， 106 （4）： 311-318.

[21]周俊， 范旭東， 董雅鳳， 等. 葡萄扇葉病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應用[J]. 園藝學報， 2016， 43（3）： 538-548.

[22]劉曉， Boscia D， Raimondi T， 等. 四川葡萄病毒病田間普查及血清學鑒定[J]. 西南農業學報， 2004，17（1）： 52-56.

[23]董雅鳳， 張尊平， 范旭東， 等. 葡萄病毒病及其防治[J]. 果樹實用技術與信息， 2010（6）： 30-32.

[24]吳斌， 馮佳， 張眉， 等. 山東鮮食葡萄主要類病毒的鑒定及序列分析[J]. 果樹學報， 2018， 35（8）： 928-935.