山東省番茄尖孢鐮刀菌的分離及鑒定

張秀 劉蕾 王輝 李文麗 王富

摘要：本研究以山東省單縣番茄枯萎病及臨淄、壽光、膠州、即墨、海陽、萊陽等地區的番茄頸腐、根腐病發病植株為主要試驗材料，對病原菌進行分離、純化及培養，并利用分子檢測技術對供試菌株進行生理小種鑒定。結果顯示，山東單縣番茄枯萎病的致病菌為番茄枯萎病菌生理小種1，其他地區番茄頸腐、根腐病致病菌為番茄枯萎病菌生理小種3。

關鍵詞：山東省;番茄;分子檢測;尖孢鐮刀菌

中圖分類號：S432.4+4?文獻標識號：A?文章編號：1001-4942（2019）12-0078-04

Abstract?In the study， tomato plants infected fusarium from Shanxian and happened neck rot and root rot in Linzi， Shouguang， Jiaozhou， Jimo， Haiyang and Laiyang areas were selected as research materials. The pathogen was isolated， purified and cultured. The physiological race of the samples were identified by molecular markers. The results showed that the pathogenic fungus of tomato fusarium wilt in Shanxian was Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici race 1， while that of tomato neck rot and root rot in other areas was Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici race 3.

Keywords?Shandong Province; Tomato; Molecular markers; Fusarium oxysporum

番茄枯萎病和番茄頸腐病是危害番茄生產的主要土傳病害，尤其在華北、東北地區發病較為嚴重[1]。有研究表明，引起番茄枯萎病和頸腐病的病原菌均為尖孢鐮刀菌[2]，尖孢鐮刀菌不同生理小種在不同植株上具有特定的致病性[3-7]。不同專化型和生理小種引起的病害需要不同的防治方法，所以準確確定?；秃蜕硇》N對預防治理由尖孢鐮刀菌引起的病害尤其重要。

雖然尖孢鐮刀菌的類型可以通過選擇性培養基上表現的形態特征來確定[8，9]，但是尖孢鐮刀菌的致病類型、?；秃头N族卻不能由此鑒定。目前最普遍的鑒定方法是利用試驗接種法確定尖孢鐮刀菌的?；秃拖鄳硇》N，但是這種方法耗時長[10，11]。本研究借助分子檢測手段對分離的病原物進行鑒定，從而明確山東省枯萎病和頸腐、根腐病病原菌的生理小種。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

采自山東省單縣、臨淄、壽光、膠州、即墨、海陽、萊陽地區番茄植株發病的根或莖。

1.2?試驗方法

1.2.1?真菌的分離、純化及培養?選用新近發病的番茄植株作為分離材料，使用之前表面噴70%乙醇。將表皮組織用滅菌解剖刀削去，在病健交界處取材，切取其中小塊變色的維管束組織，升汞滅菌后用無菌水沖洗數次，放于PDA培養基上，每個培養基放1～3塊，25℃培養5 d即可長出菌落。參照孫飛龍[12]的方法進行單孢分離。將純化的單菌落接種到PDA培養基上培養5 d，觀察菌落形態、大小和顏色等。

用移液槍吸取PDB液體培養基反復沖洗吹打菌落，將沖洗下來的孢子和菌絲加入150 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，于180 r/min的搖床上振蕩培養5 d，收集菌絲用于DNA提取。

1.2.2?DNA提取?將液體培養的真菌用三層紗布過濾后1 000 r/min離心10 min，棄掉上清液保留沉淀，在烘箱中35℃下烘12 h，即可得到干燥的菌絲。使用真菌基因組DNA提取試劑盒（Solarbio）提取真菌樣品DNA。

1.2.3?DNA濃度的檢測?取5 μL DNA樣品，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測（120 V，110 A，30 min），于Bio-RAD自動凝膠成像系統觀察條帶亮度，并使用紫外分光光度計檢測樣品DNA濃度。

1.2.4?分子檢測?用四種引物[13]（表1）分別進行PCR擴增。PCR反應體系： 模板 DNA（20～80ng/μL）2.0 μL，2× PCR Mix（含Mg2+，dNTPs，Taq DNA Polymerase等）10.0 μL，引物（10 μmol/L）各1.0 μL，滅菌超純水6.0 μL。PCR反應程序：94℃ 5 min;94℃ 30 s，56℃ （Uni）、58℃ （sp13，sp23，sprl） 30 s，72℃ 30 s，35個循環;72℃ 10 min。PCR反應結束后，取7 μL擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，采用Bio-RAD自動凝膠成像系統觀察并拍照，記錄擴增結果。

2?結果與分析

2.1?真菌的菌落形態

病原菌在PDA培養基上25℃培養5 d后，臨淄、壽光、膠州、即墨、海陽、萊陽地區的病原菌形態基本一致，菌落顏色呈淡白灰色，圓形，菌絲為絨毛狀，直徑大致60 mm;單縣分離的菌株與其它幾個地區存在明顯區別，菌落顏色呈淡粉白色，圓形，菌絲絨毛狀，長且密集，菌絲量大（圖1）。

2.2?DNA的質量與濃度檢測

經紫外分光光度計檢測，樣品DNA的OD260/OD280值在1.8 ～ 2.0范圍內，說明真菌DNA樣品質量良好。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條帶明亮且整齊無拖帶（圖2），均可用于PCR擴增。

2.3?分子標記檢測

引物unif/r和sp13f/r在所有菌株DNA中均可分別擴增出670 bp和445 bp的特異片段;引物sprlf/r在所有樣品中均未擴增出947 bp的特異片段;引物sp23f/r在除單縣外的其它地區菌株DNA中均擴增出518 bp的特征片段（圖3）。初步確定單縣枯萎病病原菌為枯萎病菌生理小種1（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici race 1， Fol 1），其它地區病原菌為枯萎病菌生理小種3（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici race 3， Fol 3）。

3?討論與結論

本研究發現，臨淄、壽光、膠州、即墨、海陽、萊陽地區的病原菌菌落特征基本一致，單縣菌株的菌落特征與其它地區有明顯區別。進一步利用分子檢測技術進行鑒定發現，臨淄、壽光、膠州、即墨、海陽、萊陽6個地區的病原菌為枯萎病菌生理小種3，單縣地區的病原菌為枯萎病菌生理小種1。

番茄頸腐、根腐病害已給美國、日本、加拿大、墨西哥、以色列、韓國以及歐洲等許多國家和地區的番茄生產造成重大損失[1]。山東省于2010年在壽光發現該病害后，該病害逐漸蔓延至全省各地;當前，此病害已經嚴重威脅到山東省溫室大棚冬春季番茄生產[14]。本研究對從山東省主要番茄產區采集的番茄頸腐、根腐病病樣進行病原菌分離、純化及鑒定，基本確定引起山東省番茄頸腐、根腐病主要病原物為番茄枯萎病生理小種3。Hirano等[13]將日本地區番茄頸腐、根腐病病原菌鑒定為Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici （FORL），可見，山東省番茄頸腐、根腐病病原菌與日本地區不同。

參?考?文?獻：

[1]?Jacobs A， Heerden S W. First report of Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici in South Africa[J]. Australasian Plant Dis. Notes， 2012， 7： 29-32.

[2]?耿麗華， 李常保， 遲勝起， 等. 番茄頸腐根腐病病原鑒定及不同條件對其生長的影響[J]. 植物病理學報， 2012， 42（5）： 449-455.

[3]?Noguez M A， Tokeshi H. Review of classification of race 3 of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici[J]. Anais Da Escola Superior De Agricultura Luiz De Queiroz， 1973， 31：419-430.

[4]?Schmidt S M， Houterman P M， Schreiver I， et al. MITEs in the promoters of effector genes allow prediction of novel virulence genes in Fusarium oxysporum[J]. BMC Genomics， 2013， 14（1）： 119-139.

[5]?Cirulli M， Alexander L G. A comparison of pathogenic isolates of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici and different sources of resistancein tomato[J]. Phytopathology， 1996， 56： 1301-1304.

[6]?Grattidge R， O'Brien R G. O′ccurrence of a third race of Fusarium wilt of tomatoes in Queensland.[J]. Plant Disease， 1982， 66（2）： 165-166.

[7]?Shiomi H， Komada H. Highly virulent isolates of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici race 2[J]. Annals of the Phytopathological Society of Japan， 2006， 72：221-222.

[8]?Laurence M H， Walsh J L， Shuttleworth L A， et al. Six novel species of Fusarium from natural ecosystems in Australia[J]. Fungal Diversity， 2015， 77（1）：1-18.

[9]?Ghiasian S A， Rezayat S M， Kord-Bacheh P， et al. Fumonisin production by Fusarium species isolated from freshly harvested corn in Iran[J]. Mycopathologia， 2005， 159（1）：31-40.

[10]Troisi M， Bertetti D， Gullino M L， et al. Race differentiation in Fusarium oxysporum f.sp. chrysanthemi[J]. Journal of Phytopathology， 2013， 161（10）：675-688.

[11]Woo S L， Zoina A， Del Sorbo G， et al. Characterization of Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli by pathogenic races， VCGs， RFLPs， and RAPD[J]. Phytopathology， 1996， 86（9）：966-973.

[12]孫飛龍. 北五味子3種病害的病原菌鑒定及有效藥劑篩選[D]. 長春：吉林農業大學， 2016.

[13] Hirano Y， Arie T. PCR-based differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici and radicis-lycopersici and races of F. oxysporum f. sp. lycopersici[J]. Journal of General Plant Pathology， 2006， 72（5）：273-283.

[14]程琳， 張生， 李艷青， 等. 番茄頸腐根腐病病原菌鑒定與抗病種質材料的篩選[J]. 園藝學報， 2016， 43（4）：781-788.