牛病毒性腹瀉病毒SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應用

任亞初 朱彤 楚會萌 程凱慧 解曉莉 張亮 孫陽陽 楊宏軍

摘要：本研究旨在建立一種靈敏度高、特異性強、重復性好，能快速檢測牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）的方法。根據BVDV的E2基因保守序列，設計合成一對特異性引物，建立了檢測BVDV的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法。將標準陽性樣品10倍梯度稀釋檢測靈敏度，用能感染奶牛的其它病毒做對照檢測特異性，用臨床樣本檢測重復性。結果表明，該方法與能感染奶牛的其它幾種病毒均無交叉反應，檢出敏感度達4.87 × 101 copies/μL，比常規PCR檢測方法高10倍。同時檢測了5個規模化奶牛場送檢的67份奶牛腹瀉樣本，其BVDV檢出率為46.27%（31/67）。本研究成功建立了BVDV SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法，為BVDV的快速診斷和定量分析提供了技術支撐，具有很好的應用前景。

關鍵詞：牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）;熒光定量PCR;E2基因;檢測

中圖分類號：S858.23?文獻標識號：A?文章編號：1001-4942（2019）12-0106-05

Abstract?The experiment was conducted to establish a method to rapidly detect bovine viral diarrhea virus with high sensitivity， high specificity and good reproducibility. In the study， a pair of specific primers were designed and synthesized according to the conservative sequence of E2 gene in BVDV， and the SYBR Green Ⅰquantitative real-time PCR detection method was established. The standard positive samples were diluted 10 times gradient to detect sensitivity. The specificity was tested with other viruses that could infect the cow， and the repeatability was tested with clinical samples. The results showed that this method did not have cross-react with other cow viruses， and the detection sensitivity was up to 4.87×101 copies/μL， which was 10 times higher than that of the conventional PCR method. At the same time， 67 diarrhea samples from 5 large-scale dairy farms were tested， and the detection rate of BVDV was 46.27% （31/67）. The study successfully established BVDV SYBR Green Ⅰ quantitative real-time PCR detection method， and provided?technical support for the rapid diagnosis and quantitative analysis of BVDV. It would have a better application prospect.

Keywords?Bovine viral diarrhea virus （BVDV）; Quantitative real-time PCR; E2 gene; Detection

牛病毒性腹瀉（bovine viral diarrhea， BVD）又稱牛病毒性腹瀉-黏膜病（bovine viral diarrhea-mucosal disease， BVD - MD），是由牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus， BVDV）引起的一種急性傳染病[1]。感染牛病毒性腹瀉病毒，輕則腹瀉、發熱、口腔及消化道粘膜發炎糜爛，重則可導致懷孕母牛流產、死胎、犢牛持續感染甚至死亡[2]。BVDV除感染牛外，還可感染豬、鹿、羊、駱駝、兔及其他野生動物，宿主相當廣泛[3]。隨著規模化養殖業的迅猛發展，BVDV的流行規模也在不斷加大，呈世界性分布，給畜牧業造成了巨大損失[4]。該病的防控方法中，有效檢出并及時淘汰是凈化畜群的重要手段[5]。因此，建立高效準確的檢測方法，對該病的臨床診斷、檢疫、流行病學調查、凈化及防治提供了有效的技術手段。

目前，牛病毒性腹瀉-粘膜病的實驗室檢測方法主要有病毒的分離和鑒定[6]、免疫熒光試驗[7]、免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）[8]、微量血清中和試驗[9]、抗原捕獲酶聯免疫吸附試驗[10]和常規PCR方法[11]等。這些方法都各有其自身的優點和適用性，但又存在缺陷。本研究利用BVDV的E2基因保守序列[12]設計引物，建立牛病毒性腹瀉病毒SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法，以期提高檢測的準確性、敏感性和特異性，為簡便省時、適于大規模 BVDV 感染的病原流行病學調查和BVDV臨床診斷、實驗室基礎研究提供技術支撐。

1?材料與方法

1.1?毒株和樣品來源

牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛腸道病毒（bovine enterovirus，BEV）、牛副流感3型病毒（bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）、牛流行熱病毒（bovine ephemeral fever virus，BEFV）等相關病毒核酸，均為山東省農業科學院奶牛研究中心疾病研究室保存。臨床檢測樣品來自2019年山東省、江蘇省、天津市的5個規模化牧場送檢樣品。

1.2?主要試劑與儀器

SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）試劑盒和病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司;Light Cycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀，羅氏公司;2×Easy Taq PCR SuperMix，購自北京全式金生物技術有限公司;pClone 007 Blunt Vector Kit，購自北京擎科生物技術有限公司。

1.3?引物的設計與合成

參考GenBank中牛病毒性腹瀉病毒的全基因組核酸序列，設計特異性擴增BVDV的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR引物，由北京擎科生物技術有限公司合成，引物序列如表1所示。

1.4?病毒RNA提取和cDNA合成

取200 μL BVDV病毒原液，按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書，提取BVDV病毒基因組RNA，然后按照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄成cDNA。

1.5?陽性標準品的制備

以提取的BVDV病毒基因組cDNA為模板，BVDV-F/R為引物進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，回收目的片段，連接至pClone 007載體，鑒定正確的重組質粒作為陽性標準品，命名為pClone 007-E2。測定質粒濃度，按照以下公式轉換成質粒的拷貝數： 拷貝數=質粒濃度×10-9×6.02×1023/（660×質粒長度），將pClone 007-E2質粒進行10倍倍比稀釋，放于-20℃冰箱備用。

1.6?建立SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法

以pClone 007-E2質粒為模板，采用方陣法對引物濃度（5～20 pmol/L）、退火溫度（55～62℃）進行摸索，最終選取Ct最小值、熒光最高值、熔解曲線特異性明顯的PCR反應條件。

采用優化完成的反應條件，以10倍梯度稀釋后的陽性標準品pClone 007-E2為模板，進行實時熒光定量PCR擴增，根據Ct值繪制標準曲線。

1.7?敏感性試驗

以稀釋后的標準品為模板，陰性對照以ddH2O為模板，進行BVDV的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR擴增，每個濃度的標準品做3個樣本檢測。同時相同濃度下進行常規PCR試驗，分析對比兩種方法的敏感性。

1.8?特異性試驗

用已建立的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR反應體系，分別以BVDV、IBRV、BPIV3、BEFV、BEV的基因組作為模板，并以ddH2O為陰性對照，分析該方法的特異性。

1.9?重復性試驗

分別取等量的4份不同拷貝（4.87×103 copies/μL，4.87×104 copies/μL，4.87×105 copies/μL，4.87×106 copies/μL）的pClone 007-E2重組質粒進行熒光定量PCR檢測（同時設置空白對照），每份拷貝樣品做3個重復，進行批內重復性試驗，通過計算 Ct值的標準差（S）和變異系數（CV）驗證熒光定量 PCR的批內重復性。另外，取以上4份樣品，在同一反應條件下間隔7 d重復一次獨立的熒光定量PCR檢測，共重復3次，然后計算 Ct值的變異系數（CV），驗證此方法的批間重復性。

1.10?臨床樣品的檢測

采用本試驗建立的 IBRV SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法檢測5個規模化奶牛場送檢的67份奶牛腹瀉樣品，同時利用普通PCR進行檢測，比較二者的檢出率，并計算二者的符合率。

2?結果與分析

2.1?質粒標準品的鑒定

以BVDV基因組cDNA為模板，利用特異性引物BVDV-F和BVDV-R進行PCR擴增，得到約185 bp左右的目的片段，與預期片段大小相同，無其他非特異性條帶，陰性對照無條帶（圖1）。將目的基因進行回收，然后連接至pClone 007載體上。提取質粒進行測序，測序結果與NCBI登錄的標準序列對比，片段插入位置正確，同源性為100%，表明標準質粒pClone 007-E2構建成功。pClone 007-E2的質粒濃度為112 ng/μL，總長度為2 096 bp，經計算拷貝數為4.87×1010 copies/μL。

2.2?SYBR Green Ⅰ 實時熒光定量PCR方法的建立

用優化后的反應條件建立標準曲線，其斜率為-3.1389，截距為30.19，相關系數為0.9931（圖2），說明Ct值與10倍梯度稀釋后的陽性標準品之間有良好的線性關系。

SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測 BVDV的熔解曲線顯示，質粒標準品均出現了單一波峰，而陰性對照未出現熔點峰（圖3），表明試驗過程中沒有出現引物二聚體及污染現象，且該引物為特異性擴增。

2.3?特異性試驗

用建立的 SYBR Green Ⅰ實時熒光定量 PCR 方法對BVDV、IBRV、BPIV3、BEFV、BEV、ddH2O進行檢測，發現只有BVDV檢測為陽性（圖4），說明該方法有很強的特異性。

2.4?敏感性試驗

將標準質粒pClone 007-E2作10倍梯度稀釋，用該方法對 4.87×107 copies/μL至 4.87×100 copies/μL的標準質粒樣品進行熒光定量PCR檢測。由圖 5可知，該方法檢出核酸的最低模板拷貝數為4.87×101 copies/μL。常規 PCR能檢出的核酸最低陽性質粒拷貝數為4.87×102 copies/μL（圖 6）。結果表明，本試驗建立的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法的敏感性高于普通 PCR檢測方法。

2.5?重復性試驗

重復性試驗結果（表2）表明，批內變異系數為0.07%～0.33%，批間變異系數為0.54%～0.71%，表明該方法具有良好的批內、批間重復性。

2.6?臨床樣本檢測

采用建立的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法檢測了5個規模化奶牛場送檢的67份奶牛腹瀉樣品，BVDV陽性31份，陽性檢出率為46.27%（31/67），而普通PCR 陽性檢出率為43.28%（29/67），符合率為106.90%。

3?討論與結論

牛病毒性腹瀉病毒可引起患病牛呈現發熱、流涎、下痢、結膜炎、口腔黏膜糜爛潰瘍，孕牛出現流產、死胎和胎兒畸形，還會引起牛的免疫抑制以及持續性感染等問題[13]。牛病毒性腹瀉病毒在世界范圍內廣泛流行，是影響養牛業健康發展的最重要疫病之一[14]。由于持續感染，牛可以長期帶毒排毒，是非常危險的傳染源[15]。因此，關于牛群的檢測、監測與淘汰對于牛病毒性腹瀉的控制非常重要。

本研究建立的牛病毒性腹瀉病毒SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法不僅兼具特異性好、敏感性高和重復性好等優點，而且操作簡單，易于進行大規模樣品檢測。此外，利用本方法檢測的樣品采樣方便，可直接檢測病原，為BVDV感染的早期診斷及病原流行病學調查提供了有效可靠的技術手段。

本研究通過對NCBI上收錄的多個BVDV序列進行比對，針對E2基因上的保守區域設計特異性引物，建立了SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法。用該方法檢測BVDV，最低檢測限為4.87×101 copies/μL，敏感性比常規PCR高10倍;檢測IBRV、BPIV3、BEFV、BEV、ddH2O等均為陰性，只有檢測BVDV的結果為陽性，說明該方法的特異性強;批內變異系數為0.07%～0.33%，批間變異系數為0.54%～0.71%，表明該方法重復性高。用建立的熒光定量PCR方法對山東、江蘇和天津3個地區5個不同牛場的67份牛腹瀉樣品進行檢測，結果表明，建立的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法陽性樣本檢出準確率高于常規PCR方法。

本試驗建立的牛病毒性腹瀉病毒E2基因的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法可以高效、準確地確定牛群中是否存在BVDV感染，為今后BVDV的防控和凈化提供了有效的技術手段，也為BVDV的實驗室研究提供了參考和理論支撐。

參?考?文?獻：

[1]?Li X P， Zhou W G， Guan P Y， et al. Research progress on pathogenesis of bovine viral diarrhoea virus[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine， 2018.

[2]?Moennig V， Becher P. Control of bovine viral diarrhea[J]. Pathogens， 2018， 7（1）：29.

[3]?陸春明， 鄢志剛， 王建. 上海嘉定、崇明地區奶牛病毒性腹瀉血清學調查研究[J]. 獸醫導刊， 2018（9）： 73-75.

[4]?Wernike K， Gethmann J， Schirrmeier H， et al. Six years （2011—2016） of mandatory nationwide bovine viral diarrhea control in Germany—a success story[J]. Pathogens， 2017， 6（4）：50.

[5]?肖盛中， 周子恒， 馬振國， 等. 牛病毒性腹瀉病毒重組E0蛋白間接ELISA方法的建立及臨床應用[C]//中國畜牧獸醫學會獸醫病理學分會第二十四次學術研討會、中國病理生理學會動物病理生理學專業委員會第二十三次學術研討會、中國實驗動物學會實驗病理學專業委員會第三次學術研討會、中國獸醫病理學家第三次學術研討會論文集. 2018.

[6]?鐘發剛， 王新華， 沈敏， 等. 牛病毒性腹瀉病毒野毒株的分離鑒定[J]. 中國預防獸醫學報， 2000， 22（6）：463-464.

[7]?趙丹， 王建華， 王萬騫. 牛病毒性腹瀉-粘膜病的檢測技術研究進展[J]. 檢驗檢疫學刊， 2014， 24（5）：68-70.

[8]?王姝. 牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白單克隆抗體的制備及IPMA方法的建立與初步應用[D]. 哈爾濱：東北農業大學， 2013.

[9]?栗銘諫， 尹安娜， 趙彩娜， 等. 牛血清中牛病毒性腹瀉/粘膜病毒抗體檢測的初步分析[J]. 甘肅畜牧獸醫， 2004， 34（6）：6-8.

[10] 羅長保， 林志雄， 魚海瓊， 等. 應用酶聯免疫吸附試驗檢測牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒[J]. 中國獸醫雜志， 2002， 38（4）：44.

[11] 王偉利， 肖成蕊， 孟日增， 等. 牛病毒性腹瀉病毒一步法RT-PCR檢測方法的建立[J]. 中國預防獸醫學報， 2007， 29（10）：806-809.

[12] Grigera P R， Marzocca M P， Capozzo A V E， et al. Presence of bovine viral diarrhea virus （BVDV） E2 glycoprotein in VSV recombinant particles and induction of neutralizing BVDV antibodies in mice[J]. Virus Research， 2000， 69（1）：3-15.

[13] 格松. 青海省玉樹地區牛病毒性腹瀉病的血清學調查[J]. 中國動物保健， 2016， 18（7）：10-11.

[14] 王國超， 白鴿， 王選， 等. 牛病毒性腹瀉-黏膜病研究概述[J]. 動物醫學進展， 2016， 37（10）：108-111.

[15] 楊立新. 牛病毒性腹瀉病毒p80蛋白單抗制備與表位鑒定及LJ36/14毒株的分離鑒定[D]. 北京：中國農業科學院， 2016.