檳榔內生真菌的分離與鑒定

海南大學園藝學院, 海南 海口 570228

檳榔(ArecacatechuL .)為棕櫚科檳榔屬常綠喬木，原產于東南亞，目前主要種植于我國的海南省，產量已經占總產量的90%以上，是海南省除橡膠產業之外的第二大支柱產業[1-2]。經國家批準，檳榔在海南省已經被列入生態經濟林樹種。檳榔還具有重要的藥用價值，位居中國四大南藥之首，其果實、種子、皮、花均可入藥。

植物內生真菌是指那些能在健康植物的不同組織或者細胞內生存，對植物組織不會引起病害癥狀的真菌[3]。一些內生真菌可形成與宿主植物具有明顯區別的代謝系統，進而產生具有很多豐富作用的次生代謝產物[4]。而藥用植物的內生真菌的研究是從1993年開始，由于能從短葉紫杉的樹皮中分離出紫杉醇，這給尋找功能性植物內生真菌提供了一個可靠的依據。種類豐富的內生真菌，產生結構多種多樣，作用十分豐富的次生代謝產物，這給今后其他植物的病蟲害防治提供一個新的思路[5-7]。由于內生真菌與宿主之間的聯系與作用，使得在植物中內生真菌的研究具有十分重要的優勢。利用現代的技術手段，提高目標化合物的產量，避免了資源浪費，同時還可以保護環境[8]。因此，在人們探索生物活性物質資源時，內生真菌具有其獨特優勢。

目前，有關檳榔內生真菌分離鑒定及其次生代謝產物相關的研究報道很少。宋薇薇等[9]從檳榔根、葉、花中分離純化得到47株內生真菌，鑒定屬于8個屬。很多研究報告發現木霉屬真菌可產生一些生物堿以及其他活性物質，可見，研究檳榔內生真菌對新活性物質的收集有良好的前景。本研究以檳榔根，葉，果為研究對象，根據ITS序列分析鑒定組織內生真菌，為進一步開展檳榔內生真菌資源收集與藥用價值開發。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本研究的植物材料采自2018年9月份萬寧市山根鎮(N18°58′8.52″, E110°28′56.28″)和萬寧市北大鎮(N18°91′8.50″, E110°29′64.30″)健康的檳榔樹(ArecacatechuL .)。主要試劑：PDA固體培養基；馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)液體培養基；8 %次氯酸鈉溶液；75 %酒精；真菌基因組DNA提取試劑盒(北京索萊寶Solarbio科技有限公司)；測序引物序列為ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；ITS1F：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'(由天一輝遠生物科技有限公司合成)。

1.2 檳榔內生真菌分離 采取健康新鮮的檳榔根、葉、果，用超純水沖洗干凈后使用2.6%次氯酸鈉和75%乙醇浸泡，浸泡時間設置5個梯度25個組合(次氯酸鈉設置時間梯度: 30 s、45 s、60 s、75 s、90 s; 乙醇設置時間梯度: 30 s、60 s、90 s、120 s、150 s)，再用無菌水沖洗3～5次。根用消毒手術刀切去頭尾，再把中間部位切成0.5～1 cm長的小段；用消毒手術刀將葉邊緣部分去除,切分成0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊；用消毒手術刀將果縱切后橫切為0.5 cm×0.5 cm。將配好的PDA培養基進行滅菌，滅菌均采用LDZX-50KBS高溫高壓滅菌鍋(生產于上海申安有限公司)，滅菌條件為121℃、20min。把各組織塊分別放在滅菌的PDA固體培養基平板上，2 min后取出放入另外干凈PDA固體培養基平板上，再將最后一次清洗組織塊的無菌水用移液槍吸取少量滴入PDA培養基中，并在實驗過程中放入空白對照，于溫度25℃恒溫箱中培養5 d左右，多次純化后試管保存。

1.3 測序鑒定 從保存的試管中刮取菌絲體接種到馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)液體培養基中，放入50 rpm/min恒溫搖床在25℃、黑暗條件下進行培養，參照真菌基因組DNA提取試劑盒的使用方法提取檳榔內生真菌DNA，再進行PCR反應(反應體系設置為25 μL,反應條件為94℃ 5 min; 94℃ 40 s,55℃ 40 s, 72℃ 55 s, 35個循環;72℃ 10 min, 4℃ ∞)。采用AGT9601PCR擴增儀(生產于杭州安杰思醫學科技有限公司)進行擴增，PCR擴增產物送往鉑尚生物技術(上海)有限公司進行測序。

1.4 數據處理 用Excel 2016軟件處理數據，NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行序列比對，MEGA5.2軟件建立系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 檳榔內生真菌分離及DNA擴增 通過平板分離法對檳榔內生真菌進行分離純化，表面消毒檢測情況顯示對照組無明顯菌落長出，表明試驗材料表面已消毒徹底，分離獲得的菌株來自檳榔組織內部。將分離得到的檳榔內生真菌進行DNA提取及rDNA-ITS序列PCR擴增，1.0 %瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴增序列條帶在600 bp左右。如圖1所示。

2.2 檳榔內生真菌鑒定 經過測序鑒定獲得了53株檳榔內生真菌，從根、葉和果中分離獲得到的內生真菌分別占14株、25株和14株(表1、表2)。通過BLAST比對初步鑒定為9個屬，分別為曲霉屬Aspergillus、刺盤孢屬Colletotrichum、鐮刀菌屬Fusarium、毛雙孢屬Lasiodiplodia、Meyerozymasp.、青霉屬Penicillium、擬莖點霉屬Phomopsis、Pleosporalessp.、木霉屬Trichoderma。基于ITS序列分析將G9-1-2、F20、G14、Y27、F13、F28、G21建立系統發育樹(圖2)，各菌株與其相似菌株的支持度可達100 %。木霉屬Trichoderma在檳榔內生真菌中為優勢菌屬，菌株比例達到了26.42% (表2)；葉部優勢菌屬也為木霉屬；而根部的優勢菌屬為曲霉屬Aspergillus。

表1 檳榔內生真菌 rDNA-ITS 序列的相似性分析

表1 檳榔內生真菌 rDNA-ITS 序列的相似性分析

注： “-”表示在相應部位沒有分離出該種屬內生真菌。

2.3 檳榔內生真菌多樣性分析 根據Shannon-Wiener 多樣性指數(H′),檳榔根、葉和果的H′值分別為0.86、1.11和 0.86，其中葉部內生真菌的多樣性最高；葉(0.57)比根(0.41)和果(0.41)的E值高，表明葉部內生真菌較為豐富且分布均勻。從根、葉和果3個部位的內生真菌種類的相似性指數來看，Cs都在0.8以上，說明各部位之間的真菌種類極為相似(表3)。從檳榔根、葉、果中分離得到的53株內生真菌中曲霉屬Aspergillus、刺盤孢屬Colletotrichum、Meyerozymasp.、青霉屬Penicillium、木霉屬Trichoderma在三個部位都存在；而鐮刀菌屬Fusarium只在葉和果中獲得，毛雙孢屬Lasiodiplodia只分布于根和果中，擬莖點霉屬Phomopsis只在根與葉中存在，Pleosporalessp.則在分離于根和果，說明同一菌屬在不同部位分布存在差異(表2)。

表2 菌屬在檳榔各部位的分離比例結果

表3 檳榔根、葉、果內生真菌多樣性

3 討論

自20世紀70年代，內生真菌被廣泛研究，尤其在經濟林木及藥用植物，包括一些藻類、蕨類都發現了內生真菌[10]。而且在同一種植物中可分離出數十種內生真菌，多則上百種，尤其從熱帶雨林植物中分離獲得的內生真菌多樣性突出。本實驗在檳榔不同根、葉、果中分離鑒定了53株內生真菌，鑒定為9個屬，其中優勢菌屬為木霉屬Trichoderma，且檳榔各組織的內生真菌分布也有差異，其葉部內生真菌分布較為豐富；而一些菌屬存在于特定組織，例如毛雙孢屬Lasiodiplodia只分布于根和果中。大量的研究也表明，內生真菌存在于植物組織內，不僅表現了普遍性，而且表現出多樣性。本試驗中根、葉和果3個部位的內生真菌種類的相似性指數Cs都在0.8以上，說明各部位之間的真菌種類極為相似。而大多數植物內生菌分布于植物不同的組織和器官內，并且宿主植物和內生真菌的種屬往往決定了它們的分布情況[11-12]。本實驗在檳榔不同部位分離的內生真菌種屬存在差異，這樣的實驗結果可能表明檳榔不同組織結構以及不同的營養條件而導致植物體內微環境有差異[13]。木霉屬從檳榔中分離的比例較高，達到了26.42%，且該屬主要分布于葉部說明該屬內生真菌表現出不同的器官或組織偏好性[14]。這與宋薇薇[9]的研究結果有差異，宋薇薇從檳榔根、葉和花中分離獲得的青霉屬(31.91%)和鐮刀菌屬(27.66%)為優勢菌屬，這可能由于種植環境條件及分離部位的差異造成[15]。

目前，很多學者對藥用植物的內生真菌進行深入探索，大量研究表明植物內生真菌能產生和宿主植物相同、類似或結構新穎的次級代謝產物，目前在藥用研究及應用上有很大的前景。張杰[16]從蛇足石杉莖中分離得到1株產生物堿的內生真菌菌株LYS081，初步鑒定也為木霉屬(Trichoderma)。檳榔中檳榔生物堿是主要活性物質，而檳榔生物堿有改善胃腸功能，治療糖尿病，促進神經興奮，預防癌癥和保護血管等作用[17]。這為有效挖掘檳榔藥用價值提供了重要線索。因此，本研究對檳榔內生真菌的分離鑒定將為檳榔內生真菌代謝產物活性研究及新化合物的開發和挖掘提供了前提條件。