壯藥白花九里明干預心肌損傷和保護心肌細胞作用的研究

右江民族醫學院，廣西 百色 533000

白花九里明[Blumeamegacephala(Randeria)]屬菊科植物，為廣西壯族民間常用藥，外敷用于治療跌打腫痛，內服用于治療風濕骨痛、月經不調、產后流血[1-2]。近年研究文獻報道，白花九里明具有鎮痛消炎、護肝止血、降壓升糖等作用[3-7]。而白花九里明對心肌缺血缺氧損傷方面影響未發現有文獻報道，本實驗采用垂體后葉素制備小鼠急性心肌缺血缺氧損傷模型，以白花九里明民間用量[1-2]換算成小鼠用量[8]給小鼠灌胃，研究白花九里明對心肌損傷的干預保護作用及作用機制，并與臨床抗心絞痛藥物硝酸甘油[9]的保心作用相比較，為白花九里明的利用與開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SPF級KM小鼠60只，雌雄各半，體質重25～35 g，由廣西右江民族醫學院動物實驗中心提供(實驗動物使用許可證號：SYXK桂2017-0004，實驗動物生產許可證號：SCXK桂2017-0003)。小鼠飼養環境為室溫18～22 ℃、濕度 50 %～60 %、日光照 12 h。實驗前適應性喂養1周。

1.2 藥材、藥品、試劑和儀器 白花九里明采于廣西百色市郊(經右江民族醫學院民族教研室覃道光教授鑒定為白花九里明植物)，曬干備用。硝酸甘油(北京益民藥業有限公司，批號：20150314)；垂體后葉素注射液(安微宏業藥業有限公司，批號：110311)；0.9%氯化鈉注射液(廣西裕源藥業有限公司，批號：L16062904)；氨基甲酸乙酯(成都市科龍化工試劑廠，批號：20161101)；甲醛(煙臺市雙雙化工有限公司，批號：20170701)；TP定量測試盒、AST測試盒、SOD測試盒、MDA測試盒 (南京建成生物工程研究所，規格：96T，批號分別為20171130、20171202、20171204、20171201)。多功能酶標儀(上海壹僑國際貿易有限公司，型號TriStar LB941)；心電圖機(廣州市艾迪科遜醫療器械有限公司，型號：ECG-6511)，數碼顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司，型號：BA2100igital)；離心機(上海安亭科學儀器廠，型號；TGL-16G)；手持臺式兩用均質器(PRO Scientific Inc Oxford CT USA，型號：PR0200)；三用恒溫水箱(江蘇金壇宏凱儀器廠，型號：HH-W600)。

1.3 白花九里明提取液的制備 將60 g白花九里明干草加入30 ℃左右的溫水2000 mL浸泡1 h，文火煮沸1 h，16層紗布過濾，保留濾液；濾渣再加入30℃左右的溫水2000 mL文火煮沸1 h，16層紗布過濾，兩次濾液合起用文火隔水濃縮至100 mL(相當于生藥600 mg/mL)，冷卻后放入4℃冰箱保存，用時以雙蒸水配制成低濃度和中濃度(150 mg/mL、300 mg/mL)的白花九里提取液。每5天提取1次。

1.4 動物分組與給藥方法 取60只健康SPF級KM小鼠隨機均分為6組。正常對照組和模型對照組(給予0.9%氯化鈉注射液灌胃)，硝酸甘油組(給予13 mg/mL灌胃)，白花九里明提取液低、中、高濃度組(分別給予150、300、600 mg/mL灌胃)；正常對照組給予0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，其余各組給予垂體后葉素注射液0.26U/mL腹腔注射；灌胃和腹腔注射的量均按小鼠 10 mL/kg體質重計算，每天1次，連續15 d。

1.5 心電圖檢測 小鼠于末次用藥前禁食12 h、禁水2 h，末次用藥后用20%氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉，通過心電圖機描記藥后10 min的心電圖肢體Ⅱ導聯波型。由同一人檢測心電圖各波段的情況。

1.6 小鼠心肌勻漿制備及心肌組織病檢 于心電圖檢測后迅速將小鼠剖胸取心臟，取右心組織放入冰凍0.9%NaCl溶液試管中用勻漿機勻漿，制成10%的心肌勻漿離心分離出上清液；取左心浸泡于10%甲醛溶液固定 30 min，再脫水、石臘包埋、HE染色制備組織切片，用數碼顯微鏡檢查心肌組織結構并攝像。

1.7 小鼠心肌總蛋白(TP)、谷草轉氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的測定 取小鼠心肌勻漿上清液，分別用TP定量測試盒、AST測試盒、SOD測試盒、MDA測試盒按說明書操作，用酶標儀檢測出心肌中TP、AST、SOD、MDA的濃度。

2 結果

2.1 各組小鼠心電圖檢測結果比較 P波時限：白花九里明中濃度組和高濃度組明顯大于正常對照組(P<0.01，0.05)，模型對照組明顯小于其余各組(P<0.01)，硝酸甘油組、白花九里明低濃度組和正常對照組的兩兩比較無統計學差異(P>0.05)。QRS波時限和P-R段時限各組間兩兩比較無統計學差異(P>0.05)。模型對照組的J點上移明顯高于其余各組(P<0.01)，其余各組J點上移的兩兩比較無統計學差異(P>0.05)。正常對照組的心率明顯低于其余各組(P<0.01，0.05)，而其余各組間的心率兩兩比較無統計學差異(P>0.05)。見表1。

組別P波時限/msQRS波時限/msP-R段時限/msJ點上移/μv心率/次/min正常對照組18.00±1.3346.00±3.066.00±0.670417.30±54.03模型對照組9.00±1.63b45.00±4.7710.00±2.6975.00±12.36b616.60±27.20b硝酸甘油組22.00±2.13d44.00±3.068.00±1.532.50±2.50d571.10±36.94b白花九里明低濃度組21.50±2.36d42.00±2.008.50±1.5015.00±6.67d606.50±38.67b白花九里明中濃度組24.50±2.17ad42.00±2.006.50±1.507.50±3.82d577.80±27.32b白花九里明高濃度組26.00±2.77bd43.00±3.356.00±0.675.00±3.33d538.60±25.89a

注:與正常對照組比較，aP<0.05,bP<0.01; 與模型對照組比較，dP<0.01。

2.2 各組小鼠心肌TP、AST、SOD、MDA檢測結果比較 正常對照組、模型對照組、硝酸甘油組、白花九里明低濃度組的TP濃度、AST濃度和SOD活性兩兩比較無統計學差異(P>0.05)；白花九里明中濃度組的TP濃度明顯高于正常對照組、硝酸甘油組、白花九里明低濃度組(P<0.05)，而SOD活性明顯低于這些組(P<0.01)；白花九里明高濃度組的TP濃度明顯高于其余組(P<0.01)，而SOD活性明顯低于其余組(P<0.01)；白花九里明中濃度組與高濃度組的AST濃度無統計學差異(P>0.05)，而均明顯低于其余各組(P<0.01)。白花九里明高濃度組和正常對照組的MDA比較無統計學差異(P>0.05)，而又明顯低于其余組(P<0.01，0.05)；白花九里明中濃度組的MDA明顯低于白花九里明低濃度組(P<0.05)。見表2。

組別TP/μg/mLAST/U/LSOD/U/mLMDA/nmol/mL正常對照組0.54±0.02210.89±17.73415.21±18.878.80±1.17模型對照組0.59±0.04200.37±16.24376.20±17.8319.95±1.19b硝酸甘油組0.54±0.03204.63±14.43420.75±26.8118.15±1.80b白花九里明低濃度組0.54±0.01190.35±7.10405.91±10.9722.35±1.96b白花九里明中濃度組0.70±0.05aeg139.79±17.22bdfg322.57±26.81bfh17.32±1.67bg白花九里明高濃度組1.06±0.10bdfhy104.52±8.75bdfh220.50±24.17bdfhy12.51±0.85dehx

注: 與正常對照組比較，aP<0.05,bP<0.01; 與模型對照組比較，dP<0.01；與硝酸甘油組比較:，eP<0.05,fP<0.01；與白花里明低濃度組比較，gP<0.05,hP<0.01；與白花里明中濃度組比較，xP<0.05,yP<0.01。

2.3 各組小鼠心肌組織切片檢查結果 正常對照組心肌細胞結構清晰，無變性壞死；模型對照組心肌細胞結構模糊而腫脹、數量明顯減少，胞質疏松，胞核數量明顯減少，心肌細胞間毛細血管明顯擴張，細胞變性壞死區域明顯；硝酸甘油組、白花九里明低濃度組和中濃度組的心肌細胞結構優與模型對照組，心肌細胞結構較為清晰，心肌細胞質疏松程度、細胞核數量、心肌細胞間毛細血管擴張和變性壞死區域等均有較大的改善；白花九里明高濃度組的心肌細胞結構清晰，沒有明顯變性壞死和毛細血管擴張現象，與正常對照組心肌細胞結構表達相接近并明顯優于白花九里明低濃度組和中濃度組。如圖1所示。

3 討論

硝酸甘油是臨床用于治療心絞痛的藥物，常以舌下含服給藥，由于舌下靜脈豐富含服的藥物易通過靜脈吸收進入血液[9]。本研究考慮到小鼠舌下含服不易實現，采用灌胃方式給藥，但消化道靜脈位于黏膜層下較深不象舌下靜脈表淺暴露，消化道黏膜層外還有大量粘稠的粘液覆蓋，而且消化道內還存在大量的消化液，考慮到這些因素會降低藥物吸收，因而本研究用舌下含服10倍藥量給硝酸甘油組小鼠灌胃作對照。

氧自由基可攻擊機體組織細胞造成損傷，SOD是組織細胞抗氧化酶能消除氧自由基，MDA是脂質過氧化產物，測定MDA含量變化能反映組織細胞脂質過氧化物程度并間接反映組織細胞被氧自由基損傷程度[10]。垂體后葉素直接作用于內臟小動脈使之收縮而減少組織器官的血流量[9]。AST是胞內酶，主要存在于心肌細胞參與合成蛋白質[11]。

心電圖的實驗結果顯示：模型對照組與正常對照組相比J點出現明顯上移，提示本實驗應用垂體后葉素成功制備心肌缺血模型[12]。硝酸甘油組和白花九里明低、中、高濃度組的J點與正常對照組比較無統計學差異而明顯低于模型對照組，提示硝酸甘油組和白花九里明都能改善垂體后葉素引起的心肌缺血狀況；硝酸甘油組和白花九里明低、中、高濃度組的心率與模型對照組比較無統計學差異而明顯高于正常對照組，提示硝酸甘油組和白花九里明都不能對抗垂體后葉素引起的心率加快。實驗結果還顯示：① 正常對照組的MDA明顯低于其余各組，提示其余各組的心肌組織細胞發生脂質過氧化；而模型對照組的心肌組織切片結果顯示，心肌細胞結構模糊而腫脹、數量明顯減少，胞質疏松，胞核數量明顯減少，心肌細胞間毛細血管明顯擴張，細胞變性壞死區域明顯，提示垂體后葉素可引起心肌細胞損傷。② 硝酸甘油組的TP、AST、SOD與正常對照組比較無統計學差異，但MDA明顯高于正常對照組而與模型對照組比較無統計學差異，其心肌組織切片結果顯示各項指示明顯優于模型對照組而趨向近于正常對照組；結合硝酸甘油組心電圖表現并提示：硝酸甘油能改善垂體后葉素引發的心肌缺血缺氧和氧自由基損傷。③心肌TP濃度隨著白花九里明濃度升高而升高、心肌AST、SOD、MDA濃度隨著白花九里明濃度升高而下降，白花九里明低濃度組的TP、AST、SOD濃度和白花九里明高濃度組的MDA濃度與正常對照組比較無顯著性差異；提示：白花九里明促進AST參與蛋白質合成而表現為心肌AST降低和TP升高為損傷組織細胞的修復提供原料，白花九里明促進SOD消除心肌組織細胞生脂質過氧化對心肌組織細胞的損傷而表現為心肌SOD、MDA濃度下降。同時心肌組織切片結果顯示：隨著白花九里明濃度的增加而心肌細胞損傷和心肌細胞間毛細血管擴張程度均越低，白花九里明高濃度組的心肌切片與正常對照組無明顯區別；提示：白花九里明保護心肌組織細胞的正常結構。再結合心電圖表現提示白花九里明能改善垂體后葉素造成的心肌缺血缺氧狀態。從這些結果分析說明：白花九里明可對抗垂體后葉素造成的心肌細胞缺血缺氧和氧自由基損傷，促進蛋白質合成，這些作用隨著白花九里明濃度增加而增強。

綜上所述，垂體后葉素可引起血管收縮[9]、氧自由基增多而造成心肌細胞缺血缺氧和損傷；硝酸甘油改善心肌細胞缺血缺氧和損傷；白花九里明能改善心肌細胞缺血缺氧、干預氧自由基對心肌細胞損傷、促進心肌細胞自我修復作用，這些作用與白花九里明消除氧自由基、解除血管收縮[6]、促進蛋白質合成有關，白花九里明的這些作用存在量效正相關；高濃度的白花九里明改善心肌細胞缺血缺氧損傷效果與硝酸甘油相當。

通過本研究得出的結論對臨床用藥有一定的指導意義，白花九里明具有改善心肌細胞缺血缺氧、抵抗氧自由基對心肌細胞攻擊損傷、促進心肌細胞自我修復作用，因此有望成為治療心肌缺血缺氧的藥物。