苗藥鐵筷子醇提物對心肌缺血性大鼠模型病理改變，血脂及TNF-α、IL-6和IL-18的影響

李雪斐 魯尚德 陳 銘 錢海兵

貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025

心肌缺血(Myocardial ischemia MI)是指由于心臟血液灌注減少，導致心肌供氧減少、心肌能量代謝紊亂，心臟不能正常工作的的一種病理狀態，是多種心臟疾病的最初階段[1]。血壓降低，主動脈供血減少，冠狀動脈阻塞，血液黏度的改變，心瓣膜病等都可以導致心肌缺血，冠狀動脈粥樣硬化是造成心肌缺血的主要原因之一，研究還發現治療血脂與炎癥，改善動脈粥樣硬化可減少心肌缺血的發生[2]。

根據心肌缺血引起的臨床表現，在中醫理論體系中可歸屬于“胸痹”“心悸”范疇，其病位在心，可累及脾肺肝腎諸臟。中醫普遍認為，該病癥是由于氣血陰陽平衡失調所導致，而氣血陰陽多由虛所致，虛又是缺血，缺氧之根本，所以病理狀態以虛實夾雜，本虛標實多見[3]。隨著對“胸痹”“心悸”的歷史認識逐漸加深，以及對古代醫家療法的繼承以及現代醫學的不斷發展，關于各種治療“胸痹”“心悸”的中藥復方和中藥單分子機制方面研究越來越多。有實驗證明由異丙腎上腺素所引起的心肌缺血，通過灌服辛溫通陽中藥，減輕大鼠心肌缺血的癥狀，其機制與血清中相關的炎性因子有關。從大量實驗及臨床觀察可以得知[4]，通過研究中藥對心肌缺血分子機理的各種調節、影響，可能找到治療心肌缺血的新方向，為臨床治療心肌缺血提供新思路、新方法。

苗藥鐵筷子(HelleborusthibetnusFranch.)為臘梅科臘梅屬(Chimonanthus)植物臘梅(ChimonanthuspraecoxL.link.)及山臘梅(Chimonanthus nitens Oliv.)的干燥根，味辛性溫，藥理研究表明，具有鎮痛、理氣、活血化瘀的功效[5]，且對于苗族人民，有長期的使用歷史，前期實驗證明臘梅葉總對心肌缺血具有保護作用[6]，但是鐵筷子醇提物對于治療心肌缺血及保護心肌的實驗研究國內外鮮少見到，因此本實驗以此為依據模擬現代人高脂高熱量飲食引起的冠心病心肌缺血，從血脂及炎癥方面進一步探索苗藥鐵筷子的作用與功效，對民族醫藥的開發和利用具有一定作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠，體重200～220 g，由長沙市天勤生物技術有限公司提供，(動物合格證編號：SCXK(湘)2014-0011)。

1.2 藥品與試劑 鐵筷子采自貴陽市烏當區三江鎮農場，經貴陽中醫學院藥學院生藥教研室劉曉龍研究員鑒定為臘梅科臘梅屬(Chimonanthus)植物臘梅的根；4%多聚甲醛(北京雷根生物技術有限公司，批號：0626-A18)；無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司,批號：20180718)；二甲苯(成都高科龍化工試劑廠，批號：2015072801)；HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：20180820)。

1.3 儀器 旋轉蒸發儀(鄭州長城科工貿有限公司R-1010)；全自動酶標儀(賽默飛世爾公司 1510)；高速臺式冷凍離心機(賽默飛世爾公司Thermo ST16R)；熒光定量 PCR 儀(成都百樂科技有限公司 CFX96TM )；石蠟切片機(德國萊卡公司RM2245)；包埋機(浙江金華科迪有限公司KD-BM)。

2 方法

2.1 供試品的制備 鐵筷子用體積分數為0.78的乙醇熱回流提取，減壓濃縮，蒸干得浸膏，得膏率約為 13.31%。

2.2 動物造模、分組及給藥 36只大鼠除正常組外，其余五組均給予高脂飼料喂養，正常組大鼠用正常飼料喂養(高脂飼料配比為：膽固醇1 %+豬油1 %+蛋黃10 %+丙硫氧嘧啶0.61 %+正常飼料粉78.39 %)，高脂飼料喂養2個月后灌胃給藥正常組、模型組、陽型組(復方丹參滴丸灌胃(67.5 mg/kg))、鐵筷子醇提物高(465.5 mg/ kg)、中(232.925 mg/ kg)、低劑量組(119.615 mg/kg)，高脂飼料喂養 2 個月后，模型組、陽性組、鐵筷子高劑量組、鐵筷子中劑量組、鐵筷子低劑量組給予腹腔注射維生素 D2(30IU/kg·d)，連續腹腔注射7 d，正常組給予腹腔注射相同劑量的生理鹽水。高脂飼料喂養6個月最后7 d，除正常組，其余各組每天給予皮下注射鹽酸異丙腎上腺素(5 mg/kg·d)，正常組給予腹腔注射相同劑量的生理鹽水，連續腹腔注射7 d。

2.3 檢測

2.3.1 病理學檢測主動脈及心肌HE染色并對病理損傷評分 動脈粥樣硬化造模完成后隨機取正常組與模型組進行動脈血管壁檢測，最后取材時在腹主動脈取血后，大鼠還有呼吸的狀態下，進行心臟的摘取、去毛、腹部及胸部皮膚消毒，沿腹部正中線剪開腹部和胸部皮膚，鈍性剝開皮膚及皮下組織，用眼科剪剪開心包膜，暴露心臟，取下心臟組織，用生理鹽水清洗心臟上的血液，將心臟放入裝有 4%多聚甲醛的 EP 管中。

2.3.2 心電圖檢測 用4%的水合氯醛腹腔注射麻醉(0.75 mL/100g)，將麻醉后的大鼠仰臥位固定于木板上，并在大鼠四肢內側皮下平刺插入針灸針，將電極連接在針灸針上，避免其他干擾因素(保證室內處于無風的環境)，在系統中選擇“循環系統，II導聯”，記錄并觀察好心電圖的變化。

2.3.3 血清血脂四項檢測 腹主動脈取血，室溫下靜置30 min后，離心機4000 rpm，15 min離心取上清，分別分裝于編號不同的 EP 管中，進行血脂四項檢測。

2.3.4 血清心肌酶及細胞因子檢測 Elisa試劑盒檢測大鼠血清CK-MM，CK-MB，TNF-α、IL-6、IL-18其步驟按照Elisa試劑盒說明書進行。

3 結果

3.1 主動脈病理學檢查 動脈粥樣硬化模型復制完成后，采用隨機原則，從正常組及模型組中選取大鼠 HE 染色(80倍)進行主動脈的觀察，與正常組相比模型組都有不同程度的脂質沉積、動脈壁增厚及斑塊出現，可以認定為動脈粥樣硬化造模成功。如圖1所示。

A B

3.2 心電圖檢測 實驗最后1天，大鼠皮下注射異丙腎上腺素 30min，在麻醉狀態下對大鼠進行心電圖檢測從心電圖(如圖2所示)中可以看出，與正常組相比，模型組出現不同程度的 ST 段的改變(ST>0.05 mV)(見表1)，可以認定心肌缺血造模成功。

組別nST/mV正常組60.022±0.004模型組60.238±0.047a陽性組60.080±0.006b高劑量組60.073±0.011b中劑量組60.244±0.081a低劑量組60.615±0.113ab

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

3.3 鐵筷子醇提物對心肌缺血病理損傷的影響 觀察心肌細胞變性、間質水腫、纖維組織增生、血管反應、炎癥細胞浸潤、出血。上述病變占組織塊的 30 %以下+(1分)，占 30 %～50 %++(2分)，占 50 %以上+++(3分)，將所有評分累加即心肌細胞損傷的評分，分級標準為0分為0級，1～3分為1級，4～7分為2級，≥8分為3級。評分結果顯示空白組和陽性組 SD 大鼠心肌細胞損傷程度明顯輕于其他各組，各組間比較有差異具有統計學意義(P<0.05)；模型組與鐵筷子醇提物高、中劑量組比較，心肌細胞損傷明顯(P<0.05)，但與鐵筷子醇提物低劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)；陽性組與鐵筷子醇提物低、中劑量組比較差異具有統計學意義(P<0.05)，與鐵筷子醇提物高劑量組比較差異無統計學意義(P<0.05)。見圖3和表2。

A組:正常組；B組:模型組；C組:復方丹參滴丸組；D組:高劑量組；E組:中劑量組；F組:低劑量組。圖3 心臟組織HE染色(X200)

表2 各組SD大鼠心肌細胞損傷評分比較 (分，

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

3.4 鐵筷子醇提物對心肌缺血模型血清血脂四項的影響 6組TG、CHOL、HDL-C、LDL-L各項表達差異有統計學意義(P<0.05)。模型組與正常組、陽性組、高劑量組、中劑量組、低劑量組比較，血脂四項的表達差異有統計學意義(P<0.05)，可以認定高脂血癥造模成功。與正常組相比，給藥組與陽性組的低密度脂蛋白偏高，高密度脂蛋白偏低，與模型組比，陽性組與給藥組低密度脂蛋白要低，高密度脂蛋白要高，說明有一定的治療效果，能降低血脂，但是效果不明顯，仍存在血管病變的危險。見表3。

組別nTGTCHDL-CLDL-C正常組60.517±0.2320.962±0.1113.850±0.3950.263±0.689模型組67.108±2.110a10.277±1.032a0.803±0.805a2.432±0.747a陽性組62.343±0.227ab1.641±0.289ab1.787±1.596ab0.780±0.521ab高劑量組60.990±0.506b1.642±0.289ab3.851±0.458b0.388±0.131ab中劑量組61.730±0.716ab2.587±0.261ab2.072±0.952ab1.455±0.333ab低劑量組62.677±0.103ab3.582±0.239ab1.585±0.195ab1.623±0.774ab

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

3.5 鐵筷子醇提物對大鼠血清心肌酶及細胞因子的影響 模型組與空白組、陽性組、高劑量組、中劑量組、低劑量組比較，血清心肌酶及各炎癥因子的表達差異有統計學意義(P<0.05)，可以認定高脂血癥造模成功；與模型組比，陽性組，鐵筷子醇提物高、中、低劑量組均血清CK-MM，CK-MB TNF-α、IL-6、IL-18明顯降低(P<0.05)提示鐵筷子醇提物具有心肌保護作用。見表4、表5。

組別nCK-MM/uU/mLCK-MB/ng/mL正常組659.883±6.826 7.700±0.811模型組6154.748±17.647a17.671±2.825a陽性組699.167±6.249ab11.405±0.903ab高劑量組663.410±14.002b8.693±2.394b中劑量組6 79.590±29.926ab12.284±1.658ab低劑量組693.253±7.977ab12.810±1.640ab

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

組別nIL-6/pg/mLIL-18/ngl/mLTNF-α/ng/mL正常組613.040±1.0726.481±0.81410.350±1.511模型組632.127±2.802a13.107±2.779a29.742±3.117a陽性組625.915±5.387ab9.188±0.908ab20.807±2.992ab高劑量組617.026±3.090ab6.455±2.391b15.970±3.866ab中劑量組623.277±2.362ab10.063±1.659ab18.167±3.100ab低劑量組625.388±3.737ab11.988±1.674a22.278±2.825ab

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

4 討論

本次實驗通過腹腔注射維生素 D2 的目的是造成血管 Ca2+的增加，從而造成血管內皮的損傷。研究表明，醫學界公認為高脂血癥是導致動脈粥樣硬化一系列心血管疾病的“罪魁禍首”，血漿中所含有的脂質包括膽固醇、甘油三酯等，在正常范圍內，這些脂類是人體所必需的營養物質，如果血脂過多，超過正常范圍，就能形成脂質代謝紊亂，血液的黏稠度增高，血流速度減慢，脂類代謝物質就會在血管壁內沉積，形成小“斑塊”，再加上維生素 D2 的作用，加重的斑塊的形成，逐漸堵塞了血管，使得血管管腔狹窄，血液流動不暢。選擇鹽酸異丙腎上腺素作為心肌缺血的造模藥物，鹽酸異丙腎上腺素具有強烈的收縮冠狀動脈的作用，同時能夠增強心肌收縮力并且能夠加快心率，從而增加心肌的耗氧量，加強心肌缺血，持續的心肌缺血能夠進一步的誘發心肌梗死。所以本實驗通過3種造模方式聯合模擬心肌缺血而導致的慢性心臟疾病，以便更能貼近臨床。動脈粥樣硬化造模完成后隨機抽取的大鼠主動脈病理切片結果與心電圖結果證明本次實驗造模成功。

血脂異常是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的一個重要的危險因素，血漿中脂質在血管壁上的沉積也是發現動脈粥樣硬化的必要前提條件。LDL-C 是指血漿中低密度脂蛋白所含的膽固醇，是導致動脈粥樣硬化的重要因素；HDL-C 具有抗動脈粥樣硬化(AS)的作用，是減少冠心病發生，發展的獨立因素，HDL 能夠抑制血小板凝聚，促進纖維蛋白溶解的作用，有利于微小血栓的形成，并且可以通過多種方式起到抗血栓作用。甘油三酯(TG)也是血漿中的重要成分，所代謝的極低密度脂蛋白(VLDL)能夠被巨噬細胞攝入進入動脈壁，產生直 AS 作用，同時還能促進血栓形成，引起血液的高凝狀態，從而增加危險度[7]。本實驗結果表明，高脂飼料喂養大鼠，模型組大鼠的 TC、TG、LDL-C 明顯升高，HDL-C下降，說明長期的高脂飲食，可以造成血脂的改變。與正常組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，與模型組比較，各項指標的表達都有一定程度的下降，均有統計學意義(P<0.05)，由結果可見，鐵筷子醇提物在一定程度上可以起到調節血脂的作用，同時可以通過降低 TG，提高 HDL-C，降低 LDL-C，阻止其氧化，抑制炎癥細胞的浸潤以及血管內血栓的形成，到達抗 AS 的作用，有效的防止高脂血癥這個早期高危因素的形成，從而進一步防止心肌缺血的形成。

腫瘤壞死標志物(TNF)是一種可以直接造成腫瘤細胞死亡的細胞因子，在心血管疾病中起主要作用的是TNF-α[8]，同時，TNF能夠直接刺激血管內皮細胞，使其血管的通透性增高，血液中的膽固醇能夠很容易的通過血管內膜，而造成膽固醇的沉積，從而形成斑塊。而且細胞受損，內膜的增厚，也能促進動脈粥樣硬化的形成，進而加重心肌缺血，因此，TNF 被認為是冠狀動脈內皮功能紊亂以及內膜增厚的主要原因[9]。IL-6又被稱為前炎癥細胞因子，在細胞因子介導的炎癥反應中與AS形成的早期階段有著重要作用[10]，IL-6能夠侵蝕斑塊內部的基質，能造成斑塊的破裂，并且血清中 IL-6濃度越高，發生心肌缺血以及心絞痛的風險也就越高，是健康人將來發生心肌梗塞的危險性的預測因子。無論是心肌缺血還是心肌梗塞等其他心血管疾病，IL-6的水平都是升高，進一步說明 IL-6與心血管疾病密切相關[11]。IL-18是炎癥反應中重要的調節因子，并且是炎癥疾病的重要介質，在炎性反應中發揮著重要的作用，血清中 IL-18水平的升高，能夠引起動脈斑塊的不穩定性。并且有相關研究證實，血清 IL-18水平的升高，甚至有可能導致斑塊的破裂，說明 IL-18或許可以對冠心病患者的發生及發展存在的因果關系[12]。

CK-MM、CK-MB 都是評價心肌缺血損傷程度的重要指標。CK-MB、CK-MM 主要分布于骨骼肌和心肌中，在各種酶中是最早進入血液中的，其分子量小，所以分布量廣，數量多，所以是心肌缺血時血清酶最早升高的一類。有文獻表明，當患者發生急性心肌梗死時，CK-MM、CK-MB 都會超過正常水平，異常升高，尤其是 CK-MB。心肌梗死時 CK-MB 保持著高水平，有文獻指出，心絞痛時血清中 CK-MB 也會表現出高水平，因此將 CK-MM、CK-MB 視為診斷急性心肌梗死的“金標準”[13-14]。

本實驗結果表明，模型組與正常組相比，模型組血清TNF-α、IL-6、IL-18 顯著升高，鐵筷子醇提物高、中、低劑量組與模型組比較，鐵筷子高劑量組血清 TNF-α 水平明顯降低(P<0.05)，中劑量與低劑量血清 TNF-α 水平有下降，其中低劑量下降差異無統計學意義(P>0.05)，說明鐵筷子醇提物能夠降低血清 TNF-α 的水平，能夠抑制炎性因子的表達，起到抗炎作用，對心肌缺血具有一定的保護作用，其中高劑量效果最為明顯。模型組中心肌酶 CK-MM、CK-MB、LDH 三項指標與正常組比顯著升高(P<0.05)，說明 ISO 可以導致心肌細胞的損傷，提示心肌缺血模型制備可靠。鐵筷子醇提物高、中、低劑量組中 CK-MM，CK-MB 指標均低于模型組(P<0.05)，證明一定劑量的鐵筷子醇提物能夠對心肌起到保護作用。