一種高純度纈草三酯的制備工藝

浦紹敬 李劍峰2* 王小婷

1.云南蘇理生物醫藥科技有限公司，云南 昆明 650000;2.云南中醫藥大學中藥學院，云南 昆明 650000

蜘蛛香(ValerianajatamansiJones)是敗醬科(Valerianaceae)纈草屬植物蜘蛛香或V.wallichii DC的根莖，又名馬蹄香、鬼見愁、豆菜根、九轉香、雷公七、小馬蹄香、臭狗藥、磨腳花、老龍須、香草子、養血蓮、臭藥、烏參、大救駕、老虎七等[1-3]。蜘蛛香為多年生草本植物，主要分布在我國西南地區，資源豐富，曾收錄于2010年版中國藥典，具有理氣止痛、消食止瀉、祛風除濕、鎮靜安神的功效，常用于腹脘脹痛、食積不化、腹瀉痢疾、風濕痹痛、腰膝酸軟、失眠等，纈草三酯是蜘蛛香主要活性成分和質量控制指標[4]。蜘蛛香的化學成分主要包括揮發油、環烯醚萜類和黃酮類化合物[5]，研究表明，蜘蛛香中的環烯醚萜類成分有鎮靜催眠、抗焦慮、抗病毒、解痙、舒張血管、松弛平滑肌和抗腫瘤等活性[6-10]。纈草三酯的化學結構在1982年已有報道，其從印度纈草中提取分離而得，含量較少。該結構經過證實具有很好的腫瘤細胞毒性，一定劑量即可殺死肝癌細胞，且未見妊娠毒性和其他毒性[11]。纈草三酯與乙酰纈草三酯化學結構相似，具有一定的穩定性，能經受短時強光照射和高溫，能耐受一定的酸性，對堿性不耐受，降解主要表現為酯鍵的水解[5]。本研究的主要意義在于，該工藝可以解決傳統提取工藝提取效率低、產物損失大、環境友好性差、藥材浪費等缺點。該工藝提取時間短、無廢氣廢水、收率高、不破壞活性成分，是目前蜘蛛香提取的最佳工藝。

1 儀器、設備和試藥

1.1 儀器 島津L2030 HPLC，VWD檢測器，工作站版本V 5.87；AB265-S分析電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；BRUKER AVⅢ HD 600核磁共振波譜儀；Agilent 6470 Triple Quad LC/MS液質連用儀。

1.2 設備 TH22-50*2中型超臨界CO2萃取設備(上海成東科技有限公司)；EZ PLUX 200D型中低壓制備液相(利惠科技)。TH22-50*2中型超臨界CO2萃取設備的結構包括：2個50 L萃取罐、1個二級分離罐、1個三級分離罐和一個冷凝器，萃取罐可交替使用，冷凝器用于CO2回收。

1.3 試劑與藥材 乙酸乙酯、石油醚(二類)均為分析純，乙腈為色譜純(默克公司)，水為娃哈哈瓶裝純凈水。蜘蛛香藥材購自云南白藥集團股份有限公司中藥飲片分公司、云南向輝藥業有限公司和昆明道地中藥飲片廠。有切片和未切片兩種，生產日期均已超過兩年。

2 方法

2.1 超臨界萃取 將切片與未切片的蜘蛛香藥材分別粉碎，無需過篩。分別裝入萃取釜中，調節萃取溫度50～55 ℃，待溫度達到后開啟CO2流量，控制在38～40 kg/h范圍內，控制萃取壓力在30～35 Mpa范圍內；一級分離罐解析壓力調節為10～15 Mpa，溫度為40～45 ℃；二級分離罐解析壓力調節為2～5 Mpa，溫度為20～25 ℃，連續萃取120 min。非揮發性組分儲存于一級分離罐的下部，揮發油儲存于二級分離罐的下部，少量揮發油被攜帶到三級分離罐和冷凝器，提取完成后與二級分離罐合并。

2.2 純化 以300～400目正相不定型硅膠作為固定相，濕法上樣，以乙酸乙酯與石油醚體積比15∶85作為流動相進行洗脫，收集UV 254 nm集中吸收部位，將該部位濃縮后進行第二次柱層析，降低乙酸乙酯與石油醚的比例至10∶90，濃縮既得黃色油狀液體。

2.3 含量測定 取上述2.2油狀液體2 mg，加乙腈10 mL溶解，取1.5 mL溶液過0.22 um濾膜備用。使用島津L2030 HPLC進行純度分析，采用面積歸一化法計算相對含量。色譜柱：WondaSil C18 Superb(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：乙睛∶水=70∶30，等度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；進樣量：2 μL。

2.4 結構分析

2.4.1 NMR 取上述2.2油狀液體10 mg于核磁管中，加入0.5 mL氘代氯仿溶解，置BRUKER AVIII HD 600核磁共振波譜儀，分別掃描1H NMR和13C NMR。

2.4.2 MS 取上述2.2油狀液體0.1 mg，加甲醇1.5 mL溶解，過0.22 μm濾膜備用。取1 μL注入Agilent 6470 Triple Quad LC/MS液質連用儀，Fragmentor 165，掃描范圍m/z: 50～1000。

3 結果與討論

3.1 意義 近年來，關于蜘蛛香活性成分和臨床運用的相關研究越來越多，且蜘蛛香是目前臨床用于治療嬰幼兒腹瀉效果最佳的中成藥。對于蜘蛛香各組分的生物活性研究已經清楚，但鮮見提取純化方面有何進展。本實驗提供一種全新高效提取工藝，彌補蜘蛛香提取工藝的缺失和缺陷。目前云南大健康產業蓬勃發展，中藥現代化就是其中非常重要的一項工作，先進的提取工藝可以推動中藥現代化的進程。

3.1 結構確認 上述2.2所得黃色油液經MS確認分子量與圖4所示結構相同。ES-MS (m/z):445.1844[M+Na]+。經核磁表征，1H NMR、13C NMR與已知文獻數據對比完全一致[13]：1H NMR(600 MHz,CDCl3) δ 6.68 (s, 1H), 5.96 (dd,J=10.1,4.5 Hz, 1H),5.85(t,J=2.8 Hz,1H),5.37-5.33(m,1H),4.74-4.62(m, 2H),3.42(dd,J=10.1,2.5 Hz, 1H),3.02(dd,J=10.0, 5.0 Hz,1H),2.89(d,J=4.9 Hz, 1H),2.23-2.20(m, 2H),2.17(d,J=7.1 Hz, 2H),2.14-2.06(m, 2H),2.04(s, 3H),0.98(s, 3H),0.97(s, 3H),0.94(s, 3H),0.93 (s, 3H)；13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ172.42,170.82,170.27,148.47,140.93,118.64,108.35,92.58,83.05,64.16,60.81,47.86,43.37,43.04,43.02,25.81,25.59,22.33,22.31,22.30,22.21,20.91.以上數據確認該工藝所得纈草三酯化學結構正確無誤。

3.2 切片對含量的影響 實驗證實，相同提起工藝下，未切片蜘蛛香原藥材中揮發油占比5%～6%，非揮發性成分占比3.5%～4.2%；經過切片的蜘蛛香飲片中揮發油占比2%～3%，非揮發性成分占比約1%，且隨著切片時間越長，含量越低。蜘蛛香的主要成分是揮發油、環烯醚萜類和黃酮類，飲片切片工藝直接破壞蜘蛛香原有保護層，導致揮發油和環烯醚萜類成分更容易揮發和破壞。飲片生產工藝不適用于蜘蛛香藥材，蜘蛛香藥材最佳保存條件應該是陰涼避光全株保存。

3.3 超臨界CO2萃取技術用于蜘蛛香提取的優點 沸點較低，蒸餾試驗發現，常壓下揮發油沸點集中在95～110 ℃范圍內；另外，環烯醚萜類化合物在高溫下易壞。傳統提取方法往往采用高溫蒸煮，在提取過程中，揮發油和纈草三酯損失嚴重，超臨界CO2萃取技術可以避免上述缺陷。除此之外，超臨界CO2萃取技術還具有如下優點：① 效率高，時間短，無需清洗，可連續生產；② 條件溫和，收率高，提取過程中損失較小；③ 無溶劑，無需做任何除溶劑處理；④ 分離效果好，可以直接將揮發油與其他成分分離；⑤ 得到的浸膏中纈草三酯含量較高，便于后續純化。

3.4 關于后續純化方法的建議 本實驗使用中低壓過柱，無法達到更高的分離度，只對纈草三酯進行初步分離。HPLC圖譜如圖1所示，纈草三酯的保留時間13.4 min，其主要雜質分別位于12.7 min和17.0 min處，據核磁數據分析，推測雜質可能是纈草三酯的類似物。核磁HNMR圖譜和CNMR圖譜分別如圖2、圖3所示，未發現明顯雜質峰。實驗不對雜質進行研究，在此不做討論。后續分離，建議采用正相高壓制備液相進行純化，使用目數更小的硅膠做固定向，采用梯度洗脫，達到更好的分離效果。

圖1 纈草三酯的HPLC圖譜

圖2 纈草三酯的1HNMR圖譜

圖3 纈草三酯的13CNMR圖譜