基于網絡藥理學方法分析小半夏湯藥效物質及作用機制

宜春學院化學與生物工程學院，江西 宜春 336000

小半夏湯出自《金匱要略·嘔吐噦下利病脈證治》第12條“諸嘔吐，谷不得下者，小半夏湯主之”[1]。全方由半夏和生姜兩味藥組成。半夏溫燥，功在滌痰化飲，降逆止嘔，為治飲病之要藥；生姜辛散，溫中降逆，消散痰飲[2]。兩藥互相配伍，為后世“見嘔止嘔”治療嘔吐的祖方[1]。現代藥理學研究表明半夏具有鎮吐、抗腫瘤、抗心律失常、抗炎、降血脂、鎮咳及糖皮質激素樣作用[3-4]。生姜主要含有揮發油、姜辣素和二苯基庚烷3大類成分，具有抗氧化、改善脂質代謝、降血脂、改善心腦血管系統功能、抗炎、抗腫瘤、降血糖等作用[5]。小半夏湯整方除止嘔外，還能抗炎[6]、治療眩暈[2]等，但其藥效物質及作用機制尚不清楚。

中藥復方是通過多成分協同作用于不同器官的多種靶標，調節機體多種生物過程和功能，進而發揮整體治療作用。網絡藥理學研究契合了這一復雜體系作用特點，為研究復方藥效物質及作用機制提供了新思路與方法[7]。本研究利用網絡藥理學方法預測小半夏湯活性成分及靶點、分析其生物功能及信號通路，旨在探索該方藥效物質及作用機制，為臨床運用提供參考。

1 資料與方法

1.1 分析平臺與軟件 ① 中藥分子機制生物信息學分析平臺BATMAN-TCM(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php/Home/Index/index)；② 中藥系統藥理學分析平臺數據庫TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)；③ 蛋白質相互作用分析平臺STRING(https://string-db.org/)；④ 人類基因組注釋數據庫DAVID6.8(https：//david.ncifcrf.gov/)；⑤ 蛋白質數據庫Uniprot(http://www.uniprot.org/)；⑥ 網絡圖形拓撲分析與編輯軟件Cytoscape ⑦ Omicshare (http://www.omics-hare．com /tools /index.php/)平臺；⑧ ClueGO基因分析軟件。

1.2 小半夏湯活性成分、靶點篩選及其網狀圖 以口服生物利用度(OB)>30%，類藥性(DL)>0.18作為條件，在TCMSP數據庫中篩選小半夏湯中半夏與生姜的活性成分及其靶點；在“藥物-靶點相似性”平臺BATMAN -TCM中，以相似性模型閥值“Score cutoff=30”為條件篩選小半夏湯中半夏與生姜的活性成分及其靶點，將二者靶點合并后與活性成分導入Cytoscape軟件，構建“小半夏湯活性成分-靶點”網狀圖。

1.3 蛋白互作網絡構建 將小半夏湯靶蛋白導入STRING數據庫，蛋白種類設置為“Homo sapiens”，最低相互作用閥值設為中等“medium confidence”，其余參數均保持默認，構建小半夏湯靶蛋白之間的相互作用網絡(protein-protein interaction network，PPI network)。將PPI網絡以TSV格式導入Cytoscape進行可視化處理，并利用“Network Analysis”功能計算各靶點度值(Degree)與介數(Betweenness)，明確小半夏湯關鍵靶基因。

1.4 GO生物過程和KEGG通路富集 采用DAVID6.8數據庫，以P-value<0.05篩選小半夏湯靶點富集的KEGG通路并歸類，運用Omicshare可視化分析KEGG通路；利用Cytoscape軟件中的“BINGO”插件對所有靶基因進行GO富集，再使用“ClueGO”插件對關鍵靶基因行GO富集，設置參數：定義來源為“Homo sapiens”(智人)，P值≤0.05，Interval Min Level=11，Max Level=13。

2 結果

2.1 小半夏湯活性成分、靶點及其網狀圖 在TCMSP數據庫及BATMAN -TCM平臺挖掘到小半夏湯12個活性成分，參考文獻[8-9]再補充鳥苷、亞油酸、姜酮及β-水芹烯，共納入16個活性成分進行研究(表1)。16個活性成分對應209個靶點，其網狀圖含有225個節點，288條邊。7個菱形節點代表來源于生姜活性成分，9個八邊形節點代表來源于半夏的活性成分，209個倒三角形節點代表活性成分對應的靶點(圖1)。網絡度值平均為18，介數平均為0.19，其中麻黃堿、β-谷甾醇、姜烯、姜醇、姜酮、纈氨酸6種化合物的度值與介數均超過均值，可能是小半夏湯的主要活性成分。

表1 小半夏湯活性成分

圖1 梔子干姜湯活性成分-靶點網絡圖

2.2 靶點PPI網絡分析 如圖2所示，PPI網絡有201個節點(8個靶點未參與互作)，1294條作用連線，平均度值為13，平均介數為0.008。SRC、MAPK1、FOS、JUN、CREB1、ESR1、BCL2、TNF、PIK3CG TH 等43個靶點的度值、介數均超過平均值，說明這些靶點在PPI網絡中處于重要位置，可能是小半夏湯發揮藥理作用的關鍵靶點。

圖2 靶蛋白PPI網絡

2.3 KEGG信號通路分析 表2是小半夏湯靶基因參與的7大類30條通路，包括6條癌癥通路、4條代謝通路、4條炎癥通路、6條神經系統通路、3條心血管系統通路、2條呼吸系統通路及5條信號轉導通路。圖3是所有通路的Omicshare點狀圖分析，由圖可見P值最小的是神經活性配體-受體相互作用通路；富集因子最高的是酪氨酸代謝；而目標基因最多的是神經活性配體-受體相互作用通路和癌癥通路。

表2 KEGG信號通路

續表2 表2 KEGG信號通路

圖3 KEGG信號通路富集

2.4 GO富集分析 利用“BiNGO”插件對209個靶點進行GO生物過程富集，最終得到P值<0.05的GO條目1915個，3435個層級連線；再通過ClueGO對小半夏湯中43個關鍵靶點進行GO分析得出12大類生物過程(圖4、圖5)，其中4類富集于神經系統方面，如興奮性突觸后電位的正調節(14.29%)、前腦神經元發育(2.04%)、神經元投影再生(4.08%)、軸突再生(4.08%)，提示小半夏湯參與的體內生物過程廣泛，尤其在神經系統方面更甚。

圖4 GO功能注釋餅狀圖

圖5 GO功能注釋網絡

3 討論

中藥復方具有多成分、多靶點、多效應的作用特點，小半夏湯功效研究目前主要局限在止嘔[10]、防眩暈[2]兩方面，其他藥理學作用及機制尚不清楚，臨床應用范圍狹窄。本研究篩選小半夏湯中16個活性成分及其209個靶點，并進行KEGG信號通路和GO生物過程富集，發現小半夏湯在炎癥、癌癥、神經以及心血管系統等多個方面都具有藥理作用。

3.1 小半夏湯在心血管及神經系統疾病方面功效研究 從小半夏湯活性成分層面來看，其在心血管及神經系統疾病方面可能存在良好的治療價值。李斌等[11]發現半夏中的麻黃堿、膽堿和鳥苷等生物堿具有抗心律失常的作用，β-谷甾醇以及棕櫚酸、亞油酸等脂肪酸類可降低血脂。姜程曦等[12]發現生姜中的6-姜酚可興奮心臟、擴張血管、促進血液循環，增加心肌細胞肌漿內質網攝取從而加強心肌收縮力。由PPI分析可知，其心血管藥理作用與GPER、SCN5A、KCNH2、PIK3CG等基因密切相關。GPER是G蛋白耦聯雌激素受體，參與調節血管內平衡、血管緊張度、血管系統受體的表達、血壓及血管細胞生長[13]；SCN5A與心房功能有密切關系[14]；KCNH2則與長QT 綜合征有關[15]；PIK3CG是影響冠心病發生的微效基因[16]，且上述基因主要富集在腎素分泌、心肌細胞腎上腺素能信號轉導等心血管通路。GO及KEGG富集顯示小半夏湯靶基因在軸突再生、中樞神經系統發育、神經元投影再生等多個神經生物過程顯著富集，參與帕金森病、γ-氨基丁酸能突觸、膽堿能突觸、5羥色胺受體、多巴胺受體信號通路等。其中5羥色胺受體與多巴胺受體與嘔吐的發生密切相關，它們的受體拮抗劑是臨床常用的止嘔藥物，這也可能是小半夏湯止嘔的中樞機理。另外，研究[17]發現半夏總生物堿不僅能改善帕金森病大鼠學習記憶功能；還能增加腦內γ-氨基丁酸含量及其受體mRNA的表達，抑制興奮性神經遞質的釋放，使腦內抑制功能增強，具有抗癲癇作用[18]。半夏中的黃芩苷通過抑制TNF-α的表達，減輕炎癥反應和修復損傷的血腦屏障，對大鼠缺血性腦損傷具有保護作用[19]。而生姜中的姜醇、姜烯和β-水芹烯等揮發油成分能顯著改善缺血再灌注模型小鼠腦組織含水量[20]；姜黃素則通過增加FOS基因表達，抑制JUN基因表達，避免神經元的缺血/再灌注損傷[21]，從而發揮腦保護作用。

3.2 該復方在癌癥和炎癥兩方面的作用及機制探討 KEGG通路分析顯示小半夏湯靶基因顯著富集在癌癥和炎癥上，前者包括前列腺癌、結直腸癌、小細胞肺癌、p53信號通路等多條癌癥通路，涉及PTEN、MAPK1、BCL2、ATF2、MAOA、TGFB1、WNT5A、CASP3和JUN等關鍵靶基因；后者參與了腫瘤壞死因子、炎性腸病、NF-kB等多條經典炎癥通路。研究發現生姜中的6-姜酚能抑制VEGF誘導的上皮血管細胞增殖[22]；6-姜烯酚能通過激活BCL2的表達，誘導人結直腸癌細胞凋亡[23]。半夏中的黃芩苷、茴香腦、亞油酸、棕櫚酸、β-谷甾醇、生物堿類都具有抗癌作用，如半夏生物堿對人肝癌細胞Bel-7402有明顯的抑制作用[24]，β-谷甾醇可加速乳腺癌細胞凋亡[25]。炎癥方面，半夏總生物堿對小鼠急性炎癥有抑制作用，對大鼠棉球肉芽腫亞急性炎癥也具有較強的抑制作用[26]；生姜中的姜醇、姜烯、β-水芹烯和姜辣素等能明顯降低小鼠毛細血管通透性，抑制二甲苯所致的耳廓炎癥，抑制肉芽組織增生[9]，這些研究都表明小半夏湯具有一定的抗癌、抗炎潛力。

此外，研究還發現小半夏湯能富集在糖尿病、百日咳等疾病，但未見相關臨床報道，需進一步深入研究。綜上所述，通過網絡藥理學分析，小半夏湯多成分-多靶點-多通路-多效應的藥理學作用得以展示，為臨床運用拓展奠定了一定的基礎。但由于網絡藥理學研究主要關注于藥物活性成分，對其在湯劑中的含量、活性成分間相互作用以及體內代謝過程等考慮不周，故研究結果尚存在一定的局限性。