民族藥材大菟絲子中綠原酸含量的測定

內蒙古自治區包頭市食品藥品檢驗檢測中心，內蒙古 包頭 014060

大菟絲子CuscutajaponicaChoisy.又名日本菟絲子，為旋花科菟絲子屬植物金燈藤的干燥成熟種子。秋季果實成熟時采收植株，曬干，打下種子，除去雜質，即可，為少數民族藥材，不得代替菟絲子，藥用時應分別入藥[1]。《內蒙古中藥材標準》(1988年版)和《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》(2003年版)均收載該品種，大菟絲子性辛、甘、平，具有補肝腎、益精髓、明目的作用，可用于腰膝酸痛、遺精、消渴、目暗、尿頻、淋瀝。《內蒙古中藥材標準》中收錄大菟絲子質量標準僅制定了[性狀]和[檢查]項[1]，《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》收錄的大菟絲子也缺少指標成分作為含量控制項目[2]，根據文獻報道[3-4]，大菟絲子含黃酮類化合物、甾類化合物和有機酸等，有機酸主要含有咖啡酸和綠原酸，其中綠原酸具有抗病毒、保肝利膽作用。瞿燕等[4]利用HPLC 法建立了大菟絲子生品和炮制品的特征圖譜，探討大菟絲子炮制前后化學成分的變化規律，并未對大菟絲子中綠原酸含量測定方法做系統性研究。馮華等[5]對黔產大菟絲子中綠原酸含量進行了測定，樣本收集僅限于貴州地區，而大菟絲子分布于我國南北各省，越南、朝鮮、日本也有[6]。本實驗采用高效液相色譜法對國內不同產地及韓國、朝鮮的9批次大菟絲子中的綠原酸含量進行測定，考察不同產地大菟絲子中綠原酸的含量差異，為提高和完善大菟絲子的質量標準提供參考依據。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀，PDA檢測器；島津UV-2450紫外分光光度計；KQ5200DE型數控超聲波清洗器。

綠原酸對照品(批號：110753-201716；中國食品藥品檢定研究院)；大菟絲子為包頭市食品藥品檢驗檢測中心收集制備并確定基源。乙腈為色譜純；水為高純水；其他試劑均為分析純。

表1 樣品來源信息表

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性 采用SHIMADZU VP-ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.05%磷酸溶液(10∶90)為流動相進行流動相條件摸索，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進樣量10 μL。綠原酸峰的理論塔板數均大于7000，與相鄰雜質峰的分離度均大于1.5。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取綠原酸對照品10.55 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液10 mL置100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得濃度為21.10 μg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取大菟絲子粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇水混合溶劑補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 采集波長的確定 取對照品溶液置于紫外分光光度計上，在210～350 nm波長范圍掃描。結果表明綠原酸在327 nm的波長處有最大吸收，故選擇327 nm作為其含量測定的檢測波長，后續方法學考察結果也表明在該波長下測定數據穩定、可靠。典型色譜圖如圖1和圖 2所示。

圖1 綠原酸對照品色譜圖

圖2 供試品色譜圖

2.4 線性關系考察 準確稱取綠原酸對照品10.55 mg，置50 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液(211.0 μg/mL)，分別精密量取儲備液0.5 mL、1 mL、2 mL、2.5 mL、1 mL、1 mL、2 mL、2.5 mL置200 mL、100 mL、100 mL、50 mL、10 mL、5 mL、5 mL、5 mL量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，得到系列濃度見表2，分別測定，以峰面積為縱坐標，綠原酸濃度為橫坐標，進行回歸分析，回歸方程為：y=34310x-38873 (x為濃度，y為峰面積)r=0.9994。綠原酸在0.5～105 μg/mL范圍內線性關系良好，結果見表2。

表2 綠原酸含量線性關系

2.5 精密度試驗 精密吸取綠原酸對照品溶液(濃度為21.10 μg/mL)10 μL，注入高效液相色譜儀, 按“2.1” 項下色譜條件連續進樣6次, 記錄綠原酸圖譜, 綠原酸平均峰面積值為655031，RSD為0.3%。表明方法的精密度良好。

2.6 穩定性考察 取同一份供試品溶液，過濾后室溫放置，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后按2.1中的色譜條件進行測定，試驗結果見表3，放置不同時間的峰面積RSD為0.2%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

表3 不同時間測定樣品中綠原酸的峰面積

2.7 重復性試驗 稱取同一供試品6份，分別照2.2.2處理并測定綠原酸含量，6份供試品綠原酸平均含量為0.1772%，RSD為0.6%，表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取已測定含量(含量0.1772%) 的同一供試品6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別置6個具塞錐形瓶中，各精密加入濃度為180.0 μg/mL的綠原酸對照品溶液各2.50 mL及50%甲醇溶液47.5 mL，按2.2.2中供試品處理方法進行處理并測定含量，結果見表4，綠原酸的平均回收率(n=6)為99.2%，RSD=0.5%，表明該方法回收率良好。

表4 綠原酸加樣回收試驗結果

3 樣品含量測定

取9批材大菟絲子，分別按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1方法測定綠原酸含量(以干基計)。結果見表5。

表5 樣品中綠原酸含量測定結果

4 討論

選用甲醇和水溶混合溶劑劑提取，分別考察15 min、30 min、45 min不同超聲提取時間對提取效率的影響，結果發現超聲提取30min，綠原酸已經基本提取完全；在提取過程中，改變甲醇-水比例(25%、50%、75%)進行提取溶劑比例的考察，發現以50%甲醇的提取效果較為理想。

通過對9個不同產地大菟絲子中綠原酸含量測定發現：綠原酸含量最高的為0.7789%(7號樣，河南)，含量最低的為0.1786%(4號樣，云南)，不同產地的大菟絲子中綠原酸的含量差異明顯，相差4倍多，制定相應質量指標限度時需要進一步考察多產地藥材數據結果。中藥材中綠原酸含量測定方法中多以磷酸調節流動相酸度[7]，在方法制定及9批大菟絲子中綠原酸含量測定實驗過程中發現，使用磷酸調節流動相酸度時，濃度不宜過高，流動相pH值過低容易造成色譜柱固定相的水解流失，引起柱效下降甚至損壞[8]，在滿足要求的前提下盡量降低使用濃度，因此，本方法流動相采用的磷酸溶液濃度為0.05%，其pH值為2.2，滿足實驗要求的同時也不會對色譜柱造成損壞。

綜上結果表明本法可靠，準確度高、重復性好，對色譜柱破壞小，可作為大菟絲子中綠原酸含量的分析方法，同時9批大兔絲子中綠原酸含量的測定結果也為相應標準中指標成分的限度制定提供參考數據。