鐵皮石斛、流蘇石斛及紫皮石斛中總多糖含量測定研究

陳 丹1 吳梅青1 張廣寧1 李金科1 李 柯2

1.湘潭醫衛職業技術學院,湖南 湘潭 411102；2.湖南省中醫藥研究院,湖南 長沙 410013

中藥石斛始載于《神農本草經》，被列為上品，具有益胃生津，滋陰清熱等功效。2015版《中藥藥典》中規定石斛為蘭科植物金釵石斛DendrobiumnobileLindl.、鼓槌石斛DendrobiumchrysotoxumLindl.或流蘇石斛DendrobiumfimbriatumHook.的栽培品及其同屬植物近似種的新鮮或干燥莖。另外，蘭科植物鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo由于使用廣泛，且野生資源稀缺，人工栽培成本高，日漸成為了名貴的中藥品種[1-2]。藥材市場上多有不法商販以同屬其它植物進行冒充，如蘭科植物紫皮石斛D.devouianum由于在外形上與鐵皮石斛極為相似，但價格又遠低于鐵皮石斛，多被用于冒充鐵皮石斛來銷售和使用[3-4]。石斛在臨床上常用于緩解人體疲勞、增強免疫力、改善胃腸道功能、治療糖尿病與輔助抗腫瘤等[5-9]，現代研究表明，石斛的藥理作用與其所含多糖有著密切關聯。本研究以葡萄糖為對照品，采用紫外分光光度法對3個不同品種多批次的石斛中總多糖含量進行測定，進一步了解不同石斛中總多糖的差異。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-2450型紫外分光光度計(日本，島津)、METTLER AE240型分析天平(瑞士METTLER)、HX-06超聲波清洗器(武漢市恒信世紀科技有限公司)、80-2離心沉淀器(上海手術器械廠)、DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 藥材與試藥 試藥：無水葡萄糖對照品(批號110833-201205，含量為99.5%，供含量測定用)均購自中國食品藥品檢定研究院；所用試劑均為分析純；純凈水：華潤怡寶飲料(中國)有限公司提供。

藥材：鐵皮石斛藥材經湖南省中醫藥研究院李若存研究員鑒定為蘭科植物鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的干燥莖；紫皮石斛藥材經湖南省中醫藥研究院李若存研究員鑒定為蘭科植物紫皮石斛Dendrobiumdevouianum的干燥莖；流蘇石斛藥材經湖南省中醫藥研究院李若存研究員鑒定為蘭科植物流蘇石斛DendrobiumfimbriatumHook.的干燥莖。樣品來源見表1。

2 總多糖含量測定[10-12]

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取無水葡萄糖對照品適量，加水制成每1 mL含0.1 mg的溶液，搖勻，即得。

2.2 標準曲線的制備 精密量取無水葡萄糖對照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.4 mL，分別置10 mL具塞試管中，各加水補至2.0 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，精密加入硫酸10 mL，搖勻，置沸水浴(98～100℃)中加熱15 min，取出，置冰浴中冷卻5 min，以相應試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(《中國藥典》2015年版四部通則0401)，在483 nm的波長處測定吸光度，結果見表2。

表1 石斛樣品來源信息

表2 線性關系考查結果

以無水葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得回歸方程為y=0.0457x+0.0536，r=0.999 3，結果表明無水葡萄糖在濃度1.742～12.191 μg·mL-1范圍內與吸光度值呈良好良性關系。

2.3 測定波長的選擇 精密量取無水葡萄糖對照品溶液1 mL，置10 mL具塞比色管中，精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻；精密加入濃硫酸10 mL，搖勻，置沸水浴中加熱15 min，取出，立即置冰浴冷卻，于400～700 nm進行掃描，得最大吸收波長。結果無水葡萄糖標準溶液在483 nm處有最大吸收，故選擇483 nm波長為測定波長。如圖1所示。

圖1 無水葡萄糖最大吸收波長掃描圖

2.4 供試品溶液的制備 取鐵皮石斛粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，加水 200 mL，加熱回流 2 h，放冷，轉移至250 mL量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液 2 mL，置 15 mL離心管中，精密加入無水乙醇8mL，搖勻，冷藏1h，取出，離心(4000轉/min)10min，棄去上清液(必要時濾過)，沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8 mL，離心，棄去上清液，沉淀以2 mol·L-1的硫酸5 mL溶解，轉移至25 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.5 測定 精密量取供試品溶液1 mL，置10 mL具塞試管中，照標準曲線制備項下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的量，計算，即得。

2.6 精密度試驗 精密量取無水葡萄糖對照品溶液1 mL，置10 mL具塞試管中，加水補至2.0 mL，照標準曲線制備項下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法測定吸光度，連續測定6次，記錄吸光度值，計算吸光度值的RSD為0.86%。結果表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗 取鐵皮石斛(批號：201603009)適量，按“2.4供試品溶液制備”項下的方法制備，并依“2.5測定”項下的方法分別于0、2、4、6、8、12 h測定吸光度值，計算吸光度值的RSD。結果表明，供試品溶液在 12 h內穩定性良好。見表3。

表3 穩定性試驗結果

2.8 重復性試驗 取鐵皮石斛(批號201603009)適量，按“2.4供試品溶液制備”項下的方法制備6份溶液，并依“2.5測定”項下的方法測定吸光度值，計算總多糖含量，結果表明，方法重復性良好。見表4。

2.9 回收率試驗 取鐵皮石斛粉末(批號201603009)，取約0.25 g，精密稱定，平行6份，加水200 mL，加熱回流2 h，放冷，轉移至250 mL量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液2 mL，分別置15 mL離心管中，精密加入無水乙醇8 mL，搖勻，冷藏1 h，取出，離心(4000轉/min)10 min，棄去上清液，沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8 mL，離心，棄去上清液，向沉淀中加入無水葡萄糖對照品溶液(0.85 mg/mL)1.0 mL，再以2 mol·L-1的硫酸5 mL溶解，轉移至25 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得供試品溶液。并依“2.5測定”項下的方法對樣品進行測定，計算葡萄糖回收率。結果見表5。

表4 重復性試驗結果

表5 回收率試驗結果

2.10 樣品含量測定 分別取鐵皮石斛、紫皮石斛與流蘇石斛適量，粉碎過三號篩，紫皮石斛取約0.5g、鐵皮石斛取約0.5g、流蘇石斛取約2g，精密稱定，分別按“2.4供試品溶液制備”項下的方法制備，并依“2.5測定”方法對樣品進行測定，計算總多糖含量。結果見表6。

表6 樣品中總多糖含量結果

續表6 表6 樣品中總多糖含量結果

3 討論

本試驗所測定的3種石斛中，紫皮石斛中總多糖含量與鐵皮石斛差異較小，含量均超過藥典中鐵皮石斛中多糖的規定，而流蘇石斛含量最低。試驗結果說明鐵皮堿石斛與紫皮石斛多糖含量相近，從多糖具有緩解人體疲勞、增強免疫力、改善胃腸道功能、治療糖尿病與輔助抗腫瘤等作用考慮，紫皮石斛同樣具有開發利用前景，但紫皮石斛是否可以替代鐵皮石斛入藥，然需要進一步進行藥效與化學成分對比研究。本實驗中3種石斛不同批次間多糖含量有差異，是因實驗采集的樣品來源于不同的產地、生態環境、生長年限均不同。

供試品溶液的制備過程中，比較了取樣量(0.25 g、0.5 g、1 g、2 g、3 g)，取樣量為0.25 g時，吸收值小于0.3，取樣量為0.5～3 g時，吸收值在0.3～0.7之間，但取樣量為2 g和3 g時，多糖含量反而減少，分析原因可能是顯色劑達到飽和，因此紫皮石斛與鐵皮石斛取樣量以0.5 g合適，但流蘇石斛因多糖含量較低，為了確保吸收值在線性范圍內，計算準確，因此取樣量以 2 g 為宜。同時比較了回流時間(1 h、2 h、3 h、4 h)，提取1 h多糖含量較低，3 h、4 h與2 h多糖含量無差別，但耗能多，因此選擇回流2 h。

加樣回收率試驗中，鐵皮石斛藥材中加入一定量無水葡萄糖按供試品溶液制備、測定，結果無水葡萄糖的的回收率僅40%～50%，分析原因是制備過程中沉淀加80%乙醇洗滌2次，無水葡萄糖因溶于80%乙醇而損失，因此將無水葡萄糖直接加入到沉淀中定容后再進行回收率試驗。