白族藥用植物長果頸黃芪根的多糖含量測定

1.大理大學藥物研究所，云南 大理 671000；2.大理大學藥學與化學學院，云南 大理 671000

黃芪為滋補類傳統中藥，性微溫、味甘，主要含黃芪皂苷類、多糖類和黃酮類生物活性物質，具有增強和調節機體免疫功能、促進機體代謝和抗疲勞等作用，在抗腫瘤、抗病毒等方面也有顯著功效[1-4]。黃芪藥材原植物為黃芪屬植物膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.或蒙古黃芪A.membranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao[5]，這兩種植物在云南無天然分布。然而，由于云南在地理、氣候等方面的多樣性，致使該地區黃芪屬植物種類十分豐富，許多分布于云南的黃芪屬植物在民間被當作草藥廣泛應用，部分種類甚至被用作正品黃芪代替品[1]。其中，在《中華本草》上稱之為“野黃芪”的長果頸黃芪(A.englerianus)就被認為具有與黃芪相似的功效[1]。長果頸黃芪主要分布于云南和西藏東南部，生于海拔2000～3700米的山坡林緣，是少數幾個在大理及周邊地區具有廣泛分布的黃芪屬植物之一。民間調研發現，大理白族地區亦將其代黃芪藥用，但對其現代研究認識卻非常有限。本團隊前期研究發現，該植物富含具有殺寄生蟲和抗氧化活性的黃酮等酚性成分，以及甾醇類化合物[6-9]。另據報道，黃芪多糖是黃芪的有效成分之一，現代藥理研究表明其具有增強機體免疫功能、改善心血管功能、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗動脈粥樣硬化、降血脂、肝保護、神經保護以及治療糖尿病等作用[10,11]。為進一步考察長果頸黃芪藥用品質相關物質基礎，本文采用硫酸-蒽酮法對其多糖含量進行了測定，為更好地開展白族藥用植物研究以及開發長果頸黃芪資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 UV-T6紫外可見分光光度計(北京普析通用有限責任公司)；80-2臺式低速離心機(上海醫療器械(集團)有限公司手術器械廠)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

葡萄糖(批號：XK13-001-2001-164II，成都化學試劑廠)；濃硫酸(批號：XK13-201-00370 008II重慶川東化工(集團)有限公司化學試劑廠)；蒽酮(批號：20071101，上海化學試劑采購供應五聯化工廠)。

長果頸黃芪(AstragalusenglerianusUlbr.)的根于2011年11月采自云南大理蒼山，由中國科學院昆明植物研究所向春雷博士鑒定，植物標本(20100928-1b)存放于大理大學藥物研究所。8個正品黃芪樣品(見表1)2011年7月購于大理白族自治州主要藥材銷售公司，經大理大學周濃副教授、肖朝江博士鑒定為正品黃芪基原植物之一膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge。

表1 8個市售黃芪樣品來源一覽表

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄糖標準液的配制 精密稱定 105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對照品 25 mg，加適量水溶解，轉移至250 mL容量瓶中，加水至刻度并搖勻，得對照品溶液(0.1 mg/mL)。

1.2.2 硫酸蒽酮試液的配制 精密稱取蒽酮 0.5 g，加80%的硫酸溶液500 mL使溶解，搖勻，即得。

1.2.3 標準曲線的制備 分別精密吸取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，置10 mL具塞試管中，加水至2.0 mL，精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL，搖勻，置水浴中加熱15min，取出，放入冰浴中冷卻15min，以相應試劑為空白對照，照紫外-可見分光光度法，在625 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.4 供試品溶液的配制 分別精密稱取上述黃芪樣品約2 g，精密稱定，置索氏提取器中，加水80 mL，熱回流提取至提取液無色，提取液轉移至100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取20 mL，加入乙醇180 mL，搖勻，4 ℃放置12 h，取出，離心10 min(3000 r/min)，傾去上清液，沉淀再加適量乙醇反復洗滌、離心2次，最后加水溶解并轉移至50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，再精密量取上述溶液10 mL至50 mL容量瓶中，加水定容搖勻，即得。

1.2.5 含量測定 精密量取供試品樣品溶液各 2 mL，分別置10 mL具塞試管中，照標準曲線制備項下的方法，自“精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中含葡萄糖的重量，計算，即得(多糖含量以無水葡萄糖計)。實驗重復3次。

2 結果

2.1 標準曲線及其回歸方程的建立 按上述實驗方法制作標準曲線如圖1所示。以吸光度值對葡萄糖濃度進行線性回歸，得回歸方程：y=0.033x-0.0148(2.5～25μg/mL，r=0.9991)；表明方程的線性非常好。

2.2 長果頸黃芪和8個正品黃芪樣品多糖含量 按上述實驗方法測得9個黃芪樣品中的多糖含量如表2所示，所有正品黃芪樣品的多糖含量均在4%以下，而大理野生的長果頸黃芪的多糖平均含量卻高達15.44%。多樣本均數兩兩比較的單因素方差分析(α=0.05，SPSS，版本19.0)結果表明：樣品2和8之間無統計學差異(P>0.05)；樣品3、5和7之間無統計學差異(P>0.05)；這兩組樣品之間以及與其他樣品之間均有統計學差異(P<0.05)。

2.3 重復性試驗 精密稱取同一黃芪樣品，按“1.2.4”和“1.2.5”項下方法，重復測定6次，從標準曲線上讀出供試品溶液中含葡萄糖的量，計算得RSD為0.12%，表明該方法重復性良好。

2.4 穩定性試驗 精密量取同一黃芪樣品溶液，按標準曲線項下方法顯色，分別在0、10、20、30、40、50、60、120 min時測定吸光度，實驗重復6次，計算得RSD為0.26%，表明樣品溶液在2 h內非常穩定。

2.5 加樣回收率試驗 精密稱取同一黃芪樣品約1 g，按樣品制備方法制備供試品溶液6份，各取1 mL，分別置6個10 mL具塞試管中，每管再精密加入對照品溶液1.0 mL，照標準曲線制備項下的方法，自“精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中含葡萄糖的重量，計算回收率(見表3)。樣品回收率為95.94%，RSD為1.19%，表明本法準確可行。

表2 黃芪樣品多糖含量測定結果

注：9和10為兩批次長果頸黃芪。

3 討論

實驗結果表明，白族藥用植物長果頸黃芪根多糖平均含量高達15.44%，與正品黃芪(平均2.81%)差異十分顯著，約5.5倍于正品黃芪。僅從多糖含量角度來看，大理野生長果頸黃芪的品質可能優于正品黃芪。但多糖結構復雜，因此該差異是否能影響黃芪的正常功效，有待進一步研究。實驗結果還發現大理州市售黃芪的多糖含量在1.81%～3.86%之間，表明各銷售公司的黃芪在品質上存在一定差異。

表3 加樣回收率試驗結果

另外，本實驗采用的方法為《中國藥典》靈芝項下用于靈芝多糖含量測定的硫酸-蒽酮法[5]。研究結果表明該法在測定黃芪多糖含量測定中顯示出較高的精密度，以及較好的穩定性和回收率，因此該法亦可用于黃芪藥材、炮制品以及含黃芪制劑的多糖含量控制。