十二時辰軟膏劑制備工藝研究

1.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003

十二時辰是閩東地區(qū)具有民族特色的畬藥，據(jù)黃澤豪等[1]考證，產(chǎn)于福建福安的畬藥十二時辰其原植物是重瓣鐵線蓮Clem-atisfloridaThunb.var.PlenaD.Don。該藥在《福安畬醫(yī)畬藥》[2]、《滇南本草》[3]、《全國中草藥匯編》[4]和《中華本草》[5]中均記載性溫、味辛。辛味能行，能活血祛瘀，性溫能溫通血脈，通則不痛，故在畬醫(yī)中取其良好的“通經(jīng)活絡，活血止痛”等功效，用于治療跌打損傷所致的血脈經(jīng)絡不通，不通則痛之關節(jié)腫痛等，引申用于由于瘀血阻滯脈絡不通的糖尿病足(脫疽)，以期達到瘀去絡通，從而達到改善或延緩糖尿病足的癥狀或進程。根據(jù)糖尿病足的致病機制以及十二時辰的性味功效，開發(fā)研制十二時辰外用制劑，為畬藥十二時辰的進一步研究利用提供理論依據(jù)，促進民族藥的開發(fā)，同時也為糖尿病足治療提供新的途徑。胡娟等[6]研究畬藥十二時辰水煎劑對小鼠的急性毒性，初步評價十二時辰口服用藥的安全性，為十二時辰軟膏劑的安全性評價提供研究基礎。本實驗以高溫試驗、低溫試驗、離心實驗和外觀性狀為評價標準，比較不同基質(zhì)的軟膏劑處方的穩(wěn)定性，選出最佳基質(zhì)處方進行單因素考察，在此基礎上采用Box-Behnken設計，選出最佳軟膏基質(zhì)配比；以藥物與基質(zhì)的不同比例制備藥膏，確定十二時辰軟膏劑的最佳含藥量，并觀察軟膏劑的外觀性狀。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；KQ-500DV數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；YP502N電子天平(上海精密科學儀器有限公司)。

1.2 試劑 無水乙醇(批號：180814，西隴科學股份有限公司)；白凡士林(批號：170809，西隴科學股份有限公司)；丙三醇(批號：20150407，國藥集團化學試劑有限公司)；十二烷基硫酸鈉(批號：E1512039，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；單硬脂酸甘油酯(批號：C10214212)、羊毛脂(批號：M58218033)、硬脂醇(批號：C10003568)、吐溫-80(批號：C10262067)、尼泊金乙酯(批號：C10107393)均購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 藥材 十二時辰藥材產(chǎn)自福建福安畬藥種植基地。

2 方法與結(jié)果

2.1 十二時辰藥液的提取 稱定十二時辰藥材(粉碎過三號篩)10.00 g，置錐形瓶中，加入50%乙醇，料液比(g/mL)為1∶30，浸泡20min，超聲提取30min，搖勻過濾，減壓濃縮至干，備用。

2.2 軟膏劑的制備 稱取處方量的羊毛脂、白凡士林、單硬脂酸甘油酯、硬脂醇作為油相，水浴加熱至80 ℃，稱取處方量的吐溫-80、十二烷基硫酸鈉、甘油作為水相，用蒸餾水溶解十二時辰提取物與水相混合，水浴加熱至80℃，將油相緩緩加入水相中, 按同一方向攪拌至冷凝。

2.2.1 軟膏劑評價方法的建立 高溫實驗(Y1)評分標準：取膏體適量裝入西林瓶中，密封，于40 ℃恒溫箱中放置24 h后，取出恢復至室溫，取樣觀察是否出現(xiàn)軟化、油水分層等現(xiàn)象。無明顯變化3分，出現(xiàn)軟化2分，有油滴析出1分，油水分層0分。

低溫實驗(Y2)評分標準：取膏體適量裝入西林瓶中，密封，于20℃冰箱中箱中放置24 h后，取出，恢復室溫取樣觀察。無明顯變化3分，變硬2分，有油滴析出1分，油水分層0分。

離心實驗(Y3)評分標準：稱取軟膏適量，置于離心管中，以3500 r/min離心10 min，取樣觀察，是否出現(xiàn)油水分層、藥物沉淀等現(xiàn)象。無變化3分，變粗2分，析出油滴1分，油水分離、藥物沉淀0分。

外觀性狀評(Y4)分標準：膏體均勻、細膩易涂布3分；膏體顆粒感、易涂布2分；膏體質(zhì)硬、不易涂布或膏體偏稀1分；油水分層0分。

以高溫實驗、低溫實驗、離心實驗結(jié)果評分和外觀性狀多指標綜合評分相加得到總分(Y)。Y=Y1+Y2+Y3+Y4

2.2.2 軟膏劑輔料及基質(zhì)的考察 軟膏劑是藥物與適宜基質(zhì)均勻混合制成的具有一定稠度的半固體外用制劑。其中基質(zhì)不僅是軟膏的賦形劑，同時對藥物的釋放和吸收有重要的影響，常用基質(zhì)分為油脂性、水溶性和乳劑型3類，本研究結(jié)合文獻方法[7-12]根據(jù)各組分的性質(zhì)，以“2.2.1項”下建立的軟膏評價方法對基質(zhì)進行預實驗組方研究，篩選不同類型的軟膏劑基質(zhì)，結(jié)果見表1。

表1 不同基質(zhì)類型處方篩選

由表1可知，在不同基質(zhì)的類型的處方中，以聚山梨酯為乳化劑的O/W型基質(zhì)在7組預實驗中綜合得分較高，在此基礎上采用單因素設計，以“2.2.1項”下建立的評價方法為標準，選取單因素實驗中對軟膏劑型影響較大的三種因素進行Box-Behnken設計優(yōu)化設計。

2.2.3 Box-Behnken設計優(yōu)化基質(zhì)處方 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以單硬脂酸甘油酯用量(A)、吐溫-80用量(B)、白凡士林用量(C)為3個考察因素，以Y為評價指標，進行實驗設計，實驗設計及結(jié)果見表2。

2.3 Box-Behnken結(jié)果分析

2.3.1 線性擬合 采用Design ExPert 8.0.6軟件，對表2數(shù)據(jù)進行Linear、2FI、Quadratic、Cubic模型擬合處理，以相關系數(shù)(R2)和置信度(P)為模型判斷標準，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Quadratic模型置信區(qū)間P<0.0001，R2=0.9409，擬合的響應面回歸模型具有極顯著差異，模型的預測值與實驗值的相關性高，可以很好地描述實驗結(jié)果，擬合2次項方程：Y=11.06-0.25A+0.75AB+1.25AC+1.75BC-2.18A2-2.68B2-1.17C2。

2.3.2 方差分析 由表3可知，此模型P<0.0001，R2=0.9409，說明該模型非常顯著可以很好地描述試驗結(jié)果。同時模型的失擬項P=0.4428>0.05，表明失擬項沒有顯著性差異，模型的實際值與預測值不擬合發(fā)生的概率低，該模型顯著且擬合方程對試驗結(jié)果預測性好。上述擬合方程中各項系數(shù)絕對值的大小直接反映了各因素對指標值的影響程度，系數(shù)的正負反映了其影響的方向。各因素對模型影響順序依次為B>A>C，即吐溫-80>單硬脂酸甘油酯>白凡士林，其中B、C的P值均小于0.0001，對模型具有極顯著性影響，吐溫-80、白凡士林是影響軟膏劑的主要因素。在各因素交互作用中AB、AC、BC、A2、B2、C2的P值均小于0.05，表明各個因素之間存在較為顯著的交互作用。

表2 Box-Behnken實驗設計及結(jié)果 (n=3)

表3 響應面實驗方差分析

續(xù)表3 表3 響應面實驗方差分析

2.3.3 效應面繪制及預測 效應面3D圖以及二維等高線圖可直觀地反應最優(yōu)條件下各因素的取值和因素間交互作用的強弱。二維圖等高線呈橢圓形且越密集，表明影響因素交互作用強，響應值大，響應面3D圖越彎曲、陡峭表明交互作用明顯。反之，交互作用弱。本實驗根據(jù)“2.3.2項”下結(jié)果，繪制效應面的3D圖及二維圖，見圖1。由二維圖可知各因素取值均在較佳范圍內(nèi)，表明在單因素篩選的基礎上進行優(yōu)化設計具有一定的科學性。其中A、B、C之間存在較強的交互作用和方差分析的結(jié)果相一致。A、B、C為影響軟膏的主要因素，Design-ExPert軟件優(yōu)選出軟膏最佳基質(zhì)單硬脂酸甘油酯：吐溫-8：白凡士林(0.8∶4∶3)，共制備軟膏30 g。

2.4 驗證實驗 為驗證模型可靠性，按上述優(yōu)化工藝進行驗證試驗，平行制作三批軟膏劑，綜合評分分別為12、12、11，預測值為12，偏差為2.78%。說明該模型穩(wěn)定可靠，結(jié)果表明，Box-Behnken法建立的模型具有良好的預測性。

2.5 軟膏載藥性能的考察 在確保軟膏劑的外觀及穩(wěn)定性前提下，按照“2.2.2項”及“2.3.3項”下處方和方法分別制備不同載藥量(10%、20%、30%)的軟膏，對軟膏進行綜合評分，考察軟膏的載藥性能，由表4可知，軟膏載藥量在10%～20%時軟膏外觀均勻細膩，易涂布，理化性質(zhì)穩(wěn)定，Y較高。軟膏的性能較為穩(wěn)定，當載藥量達到30%時，軟膏的性能變化明顯，載藥量初步定為20%。為了保證制劑的療效，應盡可能減少基質(zhì)的用量，増加藥物的用量，最終確定載藥量為20%。

表4 載藥性能的考察

3 討論

實驗前期對十二時辰的提取方式進行考察，以出膏率為評價指標，確定了以50%乙醇作為提取溶劑，料液比(g/mL)為1∶30，浸泡20min，超聲提取30min。

以綜合評分(Y)為評價指標對不同基質(zhì)處方進行篩選，確定以聚山梨酯為乳化劑的O/W型基質(zhì)最為穩(wěn)定，高、低溫實驗無軟化、變硬、油滴析出等現(xiàn)象出現(xiàn)，離心實驗無油水分層且膏體細膩易于涂布，綜合評分最高。在單因素實驗中，白凡士林、單硬脂酸甘油酯、吐溫-80、羊毛脂均對軟膏劑的成型及穩(wěn)定性有較大影響，選取影響最大的三個因素白凡士林、單硬脂酸甘油酯、吐溫-80進行Box-Behnken設計。軟膏基質(zhì)配比為單硬脂酸甘油酯：吐溫-80：白凡士林(0.8∶5∶2)，所得軟膏高溫實驗油水分層，膏體較粘稠不易涂布；配比為0.6∶4∶4，高溫實驗析出油滴，低溫變硬，膏體易于涂布但略有顆粒感；配比為0.8∶4∶3，此時十二時辰軟膏藥物混合均勻、基質(zhì)穩(wěn)定、膏體細膩易涂布。故確定軟膏基質(zhì)的最佳配比為單硬脂酸甘油酯：吐溫-80：白凡士林(0.8∶4∶3)，制備軟膏30g。

軟膏劑的乳化溫度控制應在80℃左右，溫度過高水相成分不穩(wěn)定，溫度過低融化時間較長?；|(zhì)的加熱融化時間以30 min為準，時間過短則膏體偏于稀稠不易成型；時間過長則膏體較硬不易于涂布。

綜上所述，軟膏的配方為白凡士林3g，單硬脂酸甘油酯0.8g，羊毛脂0.9g，硬脂醇1g，吐溫-804g，甘油3g，蒸餾水16g，十二烷基硫酸鈉0.5g。最佳載藥量為20%。本實驗確定了十二時辰軟膏劑的初步成型工藝，為增加治療糖尿病足的制劑品種提供了一定的研究基礎。