中藥萎胃康通過影響Hedgehog通路治療慢性萎縮性胃炎的機制研究?

陳 露，于佳寧，呂俊慧，宋漢娜，李俊材，林海燕△

(1.濱州醫學院中西醫結合學院，煙臺 264003； 2. 濱州醫學院煙臺附屬醫院兩腺外科，山東 煙臺 264100)

現代臨床將以胃黏膜腺體結構減少或消失為主要病癥的慢性炎癥定義為慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)[1]，該病屬于中醫學“痞滿”“胃脘痛”等范疇，臨床主要表現為胃脘部的痞悶不舒、胃痛嘈雜噯氣等。據不完全統計，全世界有將近一半的人群患有不同程度的慢性胃炎，而患有CAG的患者會增加癌變的風險[2]。世界衛生組織將CAG列為癌前病變，其向癌癥的轉變是一種典型的不可控制的炎癥反應[3-4]。在中國，胃癌則是引起癌癥死亡的第三大常見原因[5]。2012年胃癌死亡人數達到723000, 占總癌癥死亡率的8.8%，一躍成為世界第三大癌癥死亡原因[6]。為防止癌變，慢性萎縮性胃炎的治療尤為重要。中醫藥整體觀和辨證論治的治療原則可以針對CAG不同的臨床癥狀對癥下藥，而萎胃康正是在此原則上研制出的，本研究針對萎胃康的治療效果及可能機制進行探討。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠(160±20) g，6周齡，由山東濟南朋悅有限公司提供。

1.2 試劑與儀器

中藥萎胃康由濱州醫學院附屬醫院制劑室提供，所有藥材均符合《中國藥典》(2015版)規定。本組方主要是由西洋參、白術、白芍、延胡索、三七、熊膽和甘草等藥物組成。現將中藥稀釋成0.3 g/ml、0.15 g/ml和0.075 g/ml的水溶液，維酶素是以0.3 g/kg/d的劑量進行給藥，治療藥物配好后均放在4 ℃冰箱進行保存。水楊酸鈉(批號20170315)，北京索萊寶公司提供；兔抗Smo由Bioworld Technology公司提供，反應物種有人和大鼠(批號BS70534)；兔抗Shh由proteintech公司提供，針對物種有人、小鼠和大鼠(批號20697-1-AP)； 兔抗SuFu由proteintech公司提供，針對物種有人、小鼠和大鼠(批號26759-1-AP)；二抗試劑盒是抗鼠/兔通用型免疫組化試劑盒，由proteintech公司提供；5%羊血清封閉液，由Bioworld Technology公司提供。

2 方法

2.1 動物造模及分組

將120只健康雄性SD大鼠適應性喂養一周后，分為正常組(20只)和造模組(100只)。正常組大鼠每天進行生理鹽水灌胃以做對照，其余大鼠用水楊酸鈉按照1 ml/100 g劑量進行灌胃，前3周大鼠正常飲食飲水，后3周除正常組不做處理外其余大鼠單日足量進食，第2天禁食，飲水自由，如此反復。每周稱量大鼠體質量，觀察大鼠狀態。造模1個月后(期間死亡3只，剩余97只)正常組抽取2只大鼠(剩余18只)，造模組抽取7只大鼠(剩余90只)，解剖后HE染色觀察造模是否成功。參見《中國慢性胃炎共識意見》[7]：內鏡下觀察到胃黏膜變薄或缺損，中央有糜爛或出血，皺襞變平或者消失，胃腺體萎縮或消失。將造模組剩下的大鼠隨機分為模型組、萎胃康高中低劑量組和維酶素組5組各18只。在每只大鼠的尾巴上進行數字標號，之后進行為期1個月的藥物治療，正常組與模型組以生理鹽水灌胃，萎胃康高、中、低劑量組分別以3 g/kg/d、1.5 g/kg/d和0.75 g/kg/d的劑量灌胃，維酶素組以0.3 g/kg/d的劑量給藥。

2.2 各組大鼠體質量的觀察

每周進行體質量稱量并記錄體質量的變化，尤其是將各組大鼠治療前后的變化與正常組大鼠進行比較。

2.3 胃黏膜組織形態學觀察

分別在第10天，20天和30天的時候每組隨機抽取6只大鼠禁食24 h以上后，45 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥鈉，等大鼠進入深度麻醉后打開腹腔，迅速剪下全胃，沿胃大彎剪開，生理鹽水沖洗內容物，沖洗完畢后剪成合適大小放入裝有4%的多聚甲醛的EP管中進行固定，48 h后將甲醛沖洗干凈后進行梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋、切片，每塊切片4張，厚度為4-5 μm。一張用于H-E染色觀察胃黏膜組織形態學改變，另外3張進行免疫組化檢測各組蛋白的表達量變化。

2.4 指標檢測

免疫組化檢測各組大鼠胃黏膜的Smo、Shh和SuFu的表達量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作：將石蠟切片脫蠟至水；根據抗原抗體情況，加入檸檬酸緩沖液進行抗原熱修復，自然冷卻后PBS清洗；加入3%H2O2，室溫10 min滅活內源性酶，PBS清洗；5%羊血清室溫下封閉1小時；滴加稀釋好的一抗4 ℃冰箱過夜孵育后，PBS清洗；滴加抗兔/鼠HRP標記聚合物，37 ℃孵育30分鐘后PBS清洗；DAB顯色，鏡下控制顯色時間；蘇木精復染后蒸餾水洗滌；各級酒精由低到高濃度脫水，二甲苯中20分鐘后進行封片觀察。結果用積分光密度(IOD)表示：高倍鏡下隨機抽取五個視野，求平均值作為每張片子的積分光密度。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 大鼠體質量變化

通過稱量體質量發現，正常組大鼠體質量在實驗過程中均成直線上升趨勢；造模組在造模期間與正常組比較，體質量逐漸降低；后經過治療各個治療組大鼠體質量均成上升狀態，其中以高劑量組大鼠體質量上升趨勢最為明顯。

3.2 病理檢測結果

圖1顯示，造模后進行光鏡下觀察，可以觀察到正常組胃黏膜比較厚，上皮細胞排列整齊，固有膜腺體形狀規則；造模后的大鼠與正常組大鼠相比，胃黏膜變薄，固有膜上的腺體萎縮或消失，腺體形狀大小不一并且排列不整齊，間質有炎癥細胞浸潤，伴有腸上皮化生等變化；而在經過治療后，高劑量組中的大鼠固有膜上腺體數量增加，并且排列較模型組整齊，與正常組相似；而低劑量組相對于其余各治療組來說效果較差，說明高劑量萎胃康對CAG有良好效果。

3.3 各組大鼠胃黏膜Smo、Shh和SuFu的表達情況

表1圖2～4顯示， 大鼠胃黏膜Smo蛋白、Shh蛋白和SuFu蛋白的表達在各治療階段的正常組與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.001)，各治療階段高劑量組與其他治療組比較，差異有統計學意義(P<0.001)。正常組Smo蛋白在胞膜和胞漿中呈現一種弱陽性表達；而在模型組中，Smo蛋白在胞漿和胞膜上都可見濃染的彌散狀棕黃色表達；治療后，高劑量組中Smo蛋白的陽性表達區域局限于胞漿中，表達最少；在中劑量組和西藥組中，Smo蛋白的陽性表達在胞膜和胞漿中，陽性表達量較之低劑量組更少；低劑量組中Smo蛋白的陽性表達在胞漿和胞膜中。Shh蛋白正常狀態下會在細胞質中有少量表達；模型組中Shh蛋白在細胞質、細胞核、胞漿和胞膜上都呈現出團塊狀陽性表達；高劑量組中Shh蛋白在細胞質和細胞核中有少量陽性表達；中劑量組和西藥組中Shh蛋白的陽性表達區域主要是在細胞質中；低劑量組中Shh蛋白的陽性表達區域主要是在細胞質和胞漿中。SuFu蛋白在正常組中細胞質上有少量表達；在模型組中SuFu蛋白在細胞質和胞漿中呈現團塊狀陽性表達；高劑量組中，SuFu蛋白的陽性表達主要在細胞質中有少量表達；在中劑量組和西藥組中，SuFu蛋白的陽性表達區域主要在細胞質；而在低劑量組中，SuFu蛋白在細胞質和胞漿中有陽性表達。

注：黑色箭頭指示腸上皮化生，紅色箭頭指示腺體萎縮或消失。與正常組比較，模型組腺體萎縮或消失，大小不一，排列紊亂，腸上皮化生；經過治療后，其中除了低劑量組的效果較差外，其余各個治療組的胃腺體數量增加并且大小均勻，排列趨于整齊，高劑量組的效果最明顯，其次中劑量組和西藥組的效果也比較好圖1 各組大鼠胃黏膜的H-E染色結果(×400)

組別例數(只)Smo(IOD×104)Shh(IOD×104)SuFu(IOD×104)第10天第20天第30天第10天第20天第30天第10天第20天第30天正常組188.86±0.788.59±0.938.36±0.687.75±0.617.37±0.827.19±0.509.01±0.348.68±0.778.49±0.46模型組1856.68±1.26???54.27±2.37???53.47±2.56???47.32±2.24???45.88±2.52???43.69±1.64???48.92±3.44???45.51±3.02???43.23±2.73???萎胃康高劑量組1832.64±1.70###23.17±1.22###10.39±1.03###25.61±1.19###13.01±1.13###8.33±0.53###26.01±0.48###12.64±0.31###9.09±0.61###萎胃康中劑量組1836.86±1.63###???30.06±1.30###???20.39±1.24###???36.65±1.09###???26.38±0.97###???20.23±0.29###???37.44±0.99###???24.48±0.59###???20.47±0.83###???萎胃康低劑量組1851.45±2.21###???42.55±1.46###???30.08±0.99###???42.83±1.44###???33.06±1.99###???29.26±2.46###???40.99±1.54###???33.78±1.11###???30.59±0.47###???西藥組1838.56±0.81###???32.69±0.63###???19.71±0.42###???37.98±0.54###???24.39±0.97###???20.78±1.34###???38.17±0.86###???23.96±0.49###???20.23±0.99###???

注：與模型組比較：###P<0.001；與高劑量組比較：***P<0.001

注：箭頭表示陽性表達區域的變化，Smo在正常組的表達呈現陰性或是弱陽性；與正常組比較，模型組中Smo的陽性表達明顯增加；與模型組比較，各治療組的陽性表達都在降低；與其余治療組比較，高劑量組的陽性表達降低最顯著，與正常組表達相似；中劑量組與西藥組的表達相近，明顯低于低劑量組與模型組圖2 治療30 d后各組大鼠胃黏膜Smo表達比較(×400)

注：箭頭表示陽性表達區域的變化，Shh在正常組的表達呈現陰性或是弱陽性；與正常組比較，模型組中Shh的陽性表達明顯增加；與模型組比較，各治療組的陽性表達都在降低；與其余治療組比較，高劑量組的陽性表達降低最顯著，與正常組表達相似；中劑量組與西藥組的表達相近，明顯低于低劑量組與模型組圖3 治療30 d后各組大鼠胃黏膜Shh的表達比較(×400)

注：箭頭表示陽性表達區域的變化，SuFu在正常組的表達呈現陰性或是弱陽性；與正常組比較，模型組中SuFu的陽性表達增加；與模型組比較，各治療組的陽性表達都在降低；與其余治療組比較，高劑量組的陽性表達降低最顯著，與正常組表達相似；中劑量組與西藥組的表達相近，明顯低于低劑量組與模型組圖4 治療30 d后各組大鼠胃黏膜SuFu的表達比較(×400)

4 討論

現代醫學認為，從胃黏膜正常細胞發展到癌細胞是一個累積到質變的過程，如今被國際廣泛接受的一種發展模式便是從慢性胃炎到慢性萎縮性胃炎到腸上皮化生到異型增生， 最終導致胃癌的發生[7]。中醫認為誘導CAG的病因有很多，如脾胃素虛、飲食不調、飲酒過多、過食辛辣刺激之品等，以上因素單獨或相互作用導致脾胃虛弱，脾胃虛而不健而導致其主升降的功能受損，又容易使其他病邪侵入人體，形成氣滯血瘀之象。萎胃康由西洋參、白術、白芍、延胡索、三七、熊膽和甘草等藥物組成。西洋參為君藥，其補氣養陰、清熱生津的作用從根本上改善CAG的癥狀；白術作為臣藥主歸脾胃兩經，性味甘淡而健脾，是臨床補益脾胃之氣最主要最常用的藥物，長于補氣以復脾之健運，與西洋參配伍，加大此方補氣健脾之效；白芍長于養血斂陰柔肝，針對CAG胃脘部疼痛不舒的臨床癥狀對癥下藥；延胡索活血行氣止痛，主要針對CAG病變過程中氣滯兼見血瘀之象；三七主入胃經，能夠化瘀生新，最主要的是在化瘀過程中不會傷及人體正氣；甘草在此方中為佐使藥，其緩急止痛調和諸藥的作用主要針對CAG臨床表現中胃脘部刺痛不舒的癥狀。諸藥共同針對此病的病因病機發揮斂陰益氣、緩急止痛，清熱祛濕之功。

近年來，由于刺猬信號通路(Hedgehog)在腫瘤疾病中所起到的作用以及人們發現其活動狀態與各種腫瘤的進展具有密切關系。此通路主要是由配體Hedgehog(Hh)、膜蛋白受體(Smo和 Patched，簡稱Ptch)、下游轉錄因子神經膠質瘤關聯癌基因同源物(Gli1、Gli2和 Gli3)、類驅動蛋白2(Cos2)、絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶(Su)以及抑制劑(SuFu)等分子組成[8-9]。在此通路激活過程配體Hh中的功能是與Ptch結合，從而可以解除Ptch對Smo的抑制，便會使Hedgehog信號通路處于一種抑制的狀態。Smo是一種7次跨膜膜蛋白，在Hh不存在時與Ptch結合，受到Ptch的抑制；當Hh存在時，Ptch不再抑制Smo，Smo被磷酸化然后聚合并移動到細胞膜上，激活Fu和Cos使得SuFu失活；此前相關研究表明，有些Hedgehog抑制劑治療腫瘤的主要機制就是可以與Smo結合，以此來阻礙Smo的細胞內信號轉導，從而抑制腫瘤的增殖[10-11]。Shh蛋白參與了基因的轉錄和表達，與一系列腫瘤的發生發展有關，尤其是與消化道腫瘤更是密切相關，但是其具體機制尚不清楚。相關研究表明，Smo蛋白與SuFu蛋白在一些常見癌癥中如胃癌、乳腺癌里的表達遠遠高于癌旁組織或正常組織，說明這些蛋白在癌癥的進展中發揮著重大作用[12]。

中成藥萎胃康治療CAG是通過直接或間接影響到Hedgehog通路上的相關基因，從而改變它們的構象來抑制或是下調各蛋白的表達而起到治療作用的。相關研究表明，配體Shh與受體結合后會引起原癌基因Smo的激活，從而使整個信號通路異常激活，而萎胃康的治療機制總體上正是抑制了Hedgehog的異常激活，具體位點作用在Shh蛋白上，抑制了Shh的表達，從而使配體Shh與受體Ptch的結合受到抑制，這樣一來便會降低原癌基因Smo的增加；作為Hedgehog信號通路上的負調控因子SuFu蛋白的作用靶點是位于信號通路下游的GLi因子，與GLi結合從而抑制GLi進入細胞核內發揮其轉錄活性，科學研究表明不同組織其調控途徑的作用機制也會不同。在正常狀態下，SuFu蛋白可以抑制腫瘤的發生，在Hedgehog信號通路異常激活的狀態下，SuFu蛋白可能會發生突變，突變狀態下的SuFu蛋白就會促進腫瘤的進展，而萎胃康在治療過程中會降低突變SuFu蛋白的表達，從而抑制病程的進展。綜上所述，萎胃康對Hedgehog信號通路調控主要是分別下調Smo蛋白、Shh蛋白和突變SuFu蛋白的表達，從而抑制整條通路的異常激活來發揮作用的。

本實驗所采用的中藥復方萎胃康是傳統的中醫學理論與科學的現代醫學理論相結合而研制出來的組方，圍繞此組方在前期已經進行了很多的實驗，充分的實驗結果表明，萎胃康可以很好地改善胃黏膜的受損情況，有著對胃腺體的修復功能，在治療CAG方面取得了良好的效果。不僅如此，萎胃康在臨床方面也進行了廣泛的應用，此組方臨床治療效果較好，與常規的西醫治療比較無明顯毒副作用，并取得了很好的社會效益和經濟效益。在前期實驗中，研究者們已經分別從整體、細胞、分子、基因水平上闡述了萎胃康在治療CAG方面的可能作用機制，本實驗通過觀察萎胃康對Hedgehog信號通路上的相關因子的影響，又從另一個方面深入探討了其治療CAG的作用機制，對中醫藥在治療CAG的廣泛應用方面提供了強有力的科學依據，并開辟了一條防治新途徑。