FcγRIIB下調(diào)在腎虛型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎B細(xì)胞活化中的作用?

劉 茜，彭珊琴，趙連宇，師曉毅，李美林，徐燕萍，陳煒堅(jiān)，陳光星

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州 510405)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是最常見的自身免疫性炎性關(guān)節(jié)病，其關(guān)節(jié)的毀損嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。大量證據(jù)提示，遺傳因素參與RA的發(fā)生[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎為先天之本，主骨生髓，腎虛是RA發(fā)病的重要原因，與骨質(zhì)破壞密切相關(guān)[2]。B細(xì)胞的來源及分化發(fā)育均在骨髓之中，其免疫失耐受后會(huì)產(chǎn)生大量自身抗體，從而激發(fā)免疫炎癥，影響RA的發(fā)病[3]。研究證實(shí)，B細(xì)胞上抑制性IgG受體(FcγRIIB)可誘導(dǎo)產(chǎn)生活化抑制信號(hào)，通過負(fù)反饋限制B細(xì)胞的活化增殖[4-7]，且FcγRIIB的基因缺陷與RA關(guān)節(jié)破壞密切相關(guān)[8-9]。相較于健康對(duì)照組，腎虛型RA患者B細(xì)胞免疫失耐受與FcγRIIB在記憶B細(xì)胞及前漿細(xì)胞上表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)[10-11]。本文通過分析腎虛型RA患者B細(xì)胞活化標(biāo)志與FcγRIIB的表達(dá)情況，初步探索FcγRIIB在腎虛型RA中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例資料

表1顯示，選取 2017年9月至2018年4月期間在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕科就診的57名RA患者，其中女性患者44名，男性患者13名，男女比例為1∶3.38，接近RA性別發(fā)病比例；年齡25～70歲，平均年齡(53.79±10.23)歲；病程1～48年，平均病程(7.95±7.89)年。其中腎虛型患者27例，非腎虛型患者30例，2組患者在性別、發(fā)病年齡及病程方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。該研究獲得廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

表1 2組RA患者人口學(xué)特征比較

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 腎虛診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)1986年5月全國中西醫(yī)結(jié)合虛證與老年病研究專業(yè)委員會(huì)修訂的《中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)》[12]和國家中醫(yī)藥管理局1994年發(fā)行的《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[13]中的診斷依據(jù)：腰脊酸痛(除外傷性)脛酸軟或足跟痛；俯仰不利；發(fā)脫或齒搖；尿后有余瀝或尿失禁；性功能減退，不孕不育；肢寒畏冷 ；神倦懶動(dòng)。以上8條標(biāo)準(zhǔn)，符合5條及以上者辨證為腎虛證，不滿足辨證為非腎虛證。

1.2.2 RA診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)2009年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)制定的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

符合RA診斷標(biāo)準(zhǔn)或前期確診后的RA患者；入組年齡大于16歲，發(fā)病年齡小于71歲；簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

合并心腦腎呼吸系統(tǒng)及其他免疫類疾病或不適宜參與臨床研究的患者。

1.5 檢測(cè)及方法

1.5.1 自身抗體水平與疾病活動(dòng)情況 清晨抽取患者空腹肘靜脈血2 mL，類風(fēng)濕因子(RF)、抗CCP抗體(ACPA)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)與C-反應(yīng)蛋白(CRP)均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科完成，結(jié)果RF>20 IU/mL、ACPA>5 U/mL、CRP>8 mg/L、ESR>20 mm/h判定為陽性。疾病活動(dòng)度評(píng)分 (Disease activity score，DAS28 scores)[15]分別以ESR(DAS28 ESR scores)和CRP(DAS28 CRP scores)計(jì)算。

1.5.2 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè) 提取PBMC：真空EDTA抗凝管抽取患者空腹肘靜脈血2 mL，將新鮮全血與1640培養(yǎng)液(Gibco,31870074)1∶1混勻，緩慢加在相等比例的人外周血淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司，貨號(hào)LTS1007)液面上，1500 r不間斷離心20 min后全血混合物分層；吸出單個(gè)核細(xì)胞層，重懸于4倍體積1640培養(yǎng)液中，2300 r不間斷離心10 min，獲得細(xì)胞；細(xì)胞重懸于1 ml完全培養(yǎng)基(1640培養(yǎng)液、10%血清(Gibco, 10099141)、青鏈雙抗(Gibco,15140122))，計(jì)數(shù)后鋪板(24孔板)；加入F(ab')2 fragment goat anti-human IgM(catalog 109-006-129,Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)10ug/ml刺激培養(yǎng)48 h。

1.5.3 流式細(xì)胞學(xué)染色并檢測(cè) 流式管中依次加入Anti-Human CD19-PE-Cyanine5 (eBioscience, 85-15-0199-42) 5 μl、Anti-Human CD27-FITC(eBioscience,85-11-0279-42)5 μl、Human CD32 PE FL18.26(BD Pharmingen,550586)20 μl、Human CD86 PE-Cy7 2331(BD Pharmingen,561128) 5 μl抗體與收取的細(xì)胞混合熒光染色后上機(jī)檢測(cè)。記錄RA患者B細(xì)胞亞群上FcγRIIB與CD86熒光表達(dá)率及平均熒光強(qiáng)度(MFI)。CD32b是FcγRIIB基因蛋白表達(dá)，CD86是B細(xì)胞活化的協(xié)同共刺激分子，是B細(xì)胞表面活化的標(biāo)志，B細(xì)胞活化后其表達(dá)增加[16-17]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 2組RA患者疾病活動(dòng)情況及自身抗體水平

表2顯示，2組RA患者疾病活動(dòng)情況(壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、ESR、CRP、DAS28ESR和DAS28CRP)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而腎虛型患者ACPA水平高于非腎虛型患者，且RF低于非腎虛型患者，2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 2組RA患者疾病活動(dòng)情況及自身抗體水平比較

2.2 2組患者外周血不同亞群B細(xì)胞分子標(biāo)志的表達(dá)情況相似

圖1顯示，以CD19標(biāo)記B淋巴細(xì)胞， CD27的不同表達(dá)群劃分幼稚B細(xì)胞(CD19+ CD27-)、記憶B細(xì)胞(CD19+ CD27+)及前漿細(xì)胞(CD19+ CD27high)[18]。 對(duì)2組患者不同亞群B細(xì)胞分子標(biāo)志的表達(dá)情況進(jìn)行分析，2組在幼稚B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞及前漿細(xì)胞表達(dá)上無差異(P=0.469[1 A]，P=0.294[1B]，P=0.062[1C])。

注：①B細(xì)胞分群示意圖; ②幼稚B細(xì)胞及記憶B細(xì)胞分子標(biāo)志表達(dá); ③前漿細(xì)胞分子標(biāo)志表達(dá)圖A.幼稚B細(xì)胞；圖B.記憶B細(xì)胞；圖C.前漿細(xì)胞；與非腎虛組RA比較：P>0.05圖1 2組患者外周血不同亞群B細(xì)胞分子標(biāo)志的表達(dá)情況

2.3 腎虛型RA患者幼稚B細(xì)胞活化程度更高

圖2顯示，在IgM刺激培養(yǎng)后，腎虛型RA患者CD86的表達(dá)率明顯偏高(P=0.000)(2 A)；而2組在記憶B細(xì)胞及前漿細(xì)胞上CD86表達(dá)無差異(P=0.891[2B]，P=0.177[2C])。

注：①非腎虛型RA患者幼稚B細(xì)胞活化分子表達(dá)情況; ②腎虛型RA患者幼稚B細(xì)胞活化分子表達(dá)情況圖A.幼稚B細(xì)胞；圖B.記憶B細(xì)胞；圖C.前漿細(xì)胞；與非腎虛組RA比較：***P< 0.001圖2 2組患者外周血不同亞群B細(xì)胞活化分子標(biāo)志CD86的表達(dá)情況比較

2.4 腎虛型RA患者幼稚B細(xì)胞FcγRIIB分子標(biāo)志表達(dá)強(qiáng)度降低

圖3顯示，在IgM刺激培養(yǎng)后，腎虛型幼稚B細(xì)胞FcγRIIB的MFI較非腎虛型患者低(P=0.026)(3 A)；而2組在記憶B細(xì)胞及前漿細(xì)胞上FcγRIIB的MFI無差異(P=0.932[3B]，P=0.833[3C])。

注：與非腎虛組RA比較：***P< 0.001圖4 2組患者不同亞群B細(xì)胞之間FcγRIIB分子標(biāo)志表達(dá)變化比較

注：與非腎虛組RA比較：**P< 0.01圖5 腎虛型RA患者記憶B細(xì)胞上FcγRIIB分子標(biāo)志表達(dá)水平與ACPA抗體滴度比較

2.5 腎虛型RA患者從幼稚B細(xì)胞到記憶B細(xì)胞的FcγRIIB分子標(biāo)志表達(dá)存在下調(diào)

圖4顯示，腎虛型RA患者記憶B細(xì)胞的FcγRIIB表達(dá)率明顯較幼稚B細(xì)胞低(P=0.000)(4 A)，而非腎虛型RA患者無此差異(P=0.278)(4B)。但2組前漿細(xì)胞的FcγRIIB表達(dá)率都明顯較幼稚B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞低(P<0.05，4AB)。

2.6 腎虛型RA患者記憶B細(xì)胞FcγRIIB分子標(biāo)志表達(dá)水平與自身抗體水平相關(guān)

圖5顯示，根據(jù)Syversen SW等[19]研究，將ACPA≥200U/ml判定為高滴度陽性(高危)。57名患者中ACPA實(shí)際檢測(cè)人數(shù)腎虛組26人，非腎虛組30人。腎虛型RA患者記憶B細(xì)胞上，高滴度ACPA人群FcγRIIB的表達(dá)率明顯較低滴度人群低(P=0.004，5A)，而非腎虛型RA患者無此差異(P=0.624，5B)，提示腎虛型RA患者 FcγRIIB下調(diào)與其自身抗體分泌升高有關(guān)。

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者B細(xì)胞的免疫失耐受與其關(guān)節(jié)及軟骨的破壞密切相關(guān)[20]。目前在RA的針對(duì)性治療中，對(duì)B細(xì)胞的抑制治療往往具有良好的療效[21]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎虛是RA發(fā)病的關(guān)鍵內(nèi)因，同時(shí)也是推動(dòng)疾病發(fā)展的重要因素。動(dòng)物模型[22]與臨床研究[23-24]證實(shí)，腎虛型RA小鼠及患者關(guān)節(jié)腫脹程度、滑膜增生情況、軟骨及骨質(zhì)的破壞方面都有明顯的加重。腎主骨生髓，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的胸腺功能密切相關(guān)。B細(xì)胞在骨髓中分化及發(fā)育成熟，且B細(xì)胞表面的抑制性受體FcγRIIB能夠從骨髓的分化發(fā)育階段開始對(duì)B細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)。本研究通過分析B細(xì)胞表面活化標(biāo)志分子CD86與B細(xì)胞表面抑制性受體FcγRIIB分子標(biāo)志CD32b表達(dá)情況，證實(shí)腎虛型RA患者存在FcγRIIB水平的下調(diào)，且相較于非腎虛型RA患者，腎虛型RA患者B細(xì)胞亞群的處于更加激活的狀態(tài)。

Mackay M[4]等研究發(fā)現(xiàn)，在SLE患者幼稚B細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橛洃浖?xì)胞的同時(shí)，未能及時(shí)上調(diào)FcγRIIB的表達(dá)，導(dǎo)致其記憶B細(xì)胞表面的FcγRIIB表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組，并在正常機(jī)體B細(xì)胞活化后，F(xiàn)cγRIIB抑制性受體表達(dá)增加能夠與IgG免疫復(fù)合物結(jié)合并形成一個(gè)反饋抑制環(huán)，從而維持體內(nèi)抗體穩(wěn)態(tài)[5,7,25]。本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于非腎虛型RA患者，腎虛型RA患者從幼稚B細(xì)胞到記憶B細(xì)胞的FcγRIIB表達(dá)率存在下調(diào)，這可能與腎虛型RA患者機(jī)體反饋抑制環(huán)的破壞相關(guān)。

部分中醫(yī)風(fēng)濕病學(xué)家，如朱良春、焦樹德等[26-27]從中醫(yī)學(xué)理論腎主骨生髓出發(fā)，提出腎虛會(huì)導(dǎo)致腎臟功能的紊亂，進(jìn)而造成關(guān)節(jié)與骨的破壞。然而目前對(duì)于腎虛與RA關(guān)節(jié)破壞相關(guān)，及對(duì)腎虛型RA的從腎論治仍然缺乏理論支持。眾所周知，ACPA作為RA特異性極高的抗體[28]，是由RA患者B細(xì)胞自發(fā)分泌的，而其他免疫性疾病及健康人群的B細(xì)胞則不分泌該抗體。近年來研究表明，RA患者血清中自身抗體水平的高低與關(guān)節(jié)的破壞程度相關(guān)[29]。雖然ACPA滴度高低與患者疾病活動(dòng)度無關(guān)[29-31]，但卻可能會(huì)對(duì)RA患者關(guān)節(jié)破壞的速度及強(qiáng)度產(chǎn)生影響[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，腎虛型RA患者記憶B細(xì)胞、FcγRIIB的表達(dá)率與ACPA滴度的高低有關(guān)，ACPA水平越高，其記憶B細(xì)胞的FcγRIIB表達(dá)率越低，提示除了病因以外，F(xiàn)cγRIIB的下調(diào)能夠?qū)е伦陨砜贵w水平的升高，進(jìn)而使腎虛型RA患者產(chǎn)生更加嚴(yán)重的骨質(zhì)侵蝕與破壞。

綜上所述，腎虛型 RA患者存在FcγRIIB水平的下調(diào)，能夠促進(jìn)B細(xì)胞過度活化和自身抗體水平升高，與其關(guān)節(jié)破壞程度有關(guān)，這一研究為臨床從腎論治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供理論支持。