Mash-1基因對神經干細胞分化與神經發育的影響研究進展

李澤平， 陳彥霖，李曉苗，焦慧鳳

1.南昌大學瑪麗女王學院(南昌330031)；2.空軍軍醫大學西京醫院(西安 710032)，3.南昌大學生命科學院(南昌330031)

神經干細胞(Neural stem cell，NSC)起源于多能干細胞，具有自我復制和多向分化的潛能，并在學習記憶和海馬突觸可塑性中起重要作用。Mash-1基因是堿性螺旋-環-螺旋基因(basic helix-loop-helex，bHLH)家族的一類成員。bHLH家族因在一個近60個氨基酸的片段內具有特征性的bHLH序列模式而得名。多種細胞和組織分化發育的過程由此家族調控，對神經發育有重大意義。近年研究表明Mash-1基因對NSC有正性調控作用。作為哺乳動物早期神經發育的關鍵性基因之一，Mash-1的表達有助于多功能細胞向神經祖細胞分化并產生神經元的過程[1]。此外，bHLH家族中的負性調控基因Hes可以抑制Mash-1的表達，同時bHLH基因也被Notch信號調控。本文對Mash-1蛋白特性和notch、Hes-1對Mash-1通路影響以及Mash-1對神經干細胞發育神經發生予以綜述。

1 Mash-1基因及Mash-1蛋白功能特性

Mash-1對哺乳動物的神經發生具有重要意義，敲除這些基因會導致特定神經元亞型的缺失。Mash-1蛋白分子量約為34kD，其具有bHLH結構，可以與啟動子E-BOX特異性結合，與E蛋白如E12和E47結合，啟動下游基因的轉錄。有研究表明，Mash-1基因的負調控作用與Id競爭性地和E蛋白結合有密切聯系[1]。Mash-1基因在CNS的發育中被Notch介導的一系列信號所調控。而且BMP、ras基因、hedgehog和Wnt通路也可作為其調控神經發育的影響因素[2]。Mash-1除上述互相調控外，通過維持其持續表達可以使BMP誘導NSC向神經元分化，并對BMP-2誘導膠質細胞的分化具有抑制作用。在NSC向神經細胞及中間神經元分化的過程中，MDLX基因可作為Mash-1誘導的靶基因，繼而DLX-2誘導谷氨酸脫羧酶67對于GABA能神經元分化產生抑制作用[3]。

2 Notch信號通路對Mash-1基因的調控作用

Notch基因編碼的Notch蛋白和Notch配體、DNA結合蛋白、其他效應物[3]以及相關調節分子共同組成了Notch通路在中樞神經系統發育過程里，Notch介導的一系列信號可調控Mash-1基因的轉錄。研究表明，Mash-1可通過NRSF/REST轉錄復合物相結合而激活[4]。NRSF/REST是保持神經未分化狀態的關鍵性轉錄因子，其存在于Notch通路中。

另一方面Notch可以通過調控Hes基因來間接調控Mash-1的表達(見下文)。Notch激活時，其結構發生變化并釋放細胞內結構區[2](ICD),該結構區進入細胞核與RBP-J形成復合物。RBP-J可通過結合Hes蛋白的啟動子抑制轉錄，下調Hes1與Hes5表達[4]。但當RBP-J與ICD結合后，則會產生相反的作用。

Delta1(Dll1)的表達被mash-1所調控，Dll1可與相鄰細胞的Notch信號結合進行調節[5]。Hes5可以抑制NGND等基因的表達[4],NGND也可調節Dll1的表達。由此也印證了，下一步會分化為原始神經元的細胞Notch信號表達較弱。實驗證明[5]，Mash-1對早期室管膜區的神經前體細胞的分化起推動作用，如果Notch信號丟失,神經前體細胞則會缺失,除Notch缺失細胞外，Mash-1均表達正常。

3 Hes基因對Mash-1基因的調控作用

Hes基因是一種負調控型的bHLH轉錄因子,其作用體現在維持神經干細胞增殖,使大腦細胞具有正確的數目、形態和細胞排列等方面。相反的是正調控型轉錄因子Mash-1基因,其具有促進神經前體細胞向神經元分化的功能。[6]正調控型和負調控型bHLH轉錄因子之間拮抗式的互相作用意味著二者共同控制神經干細胞的分化并且決定細胞命運。Hes家族成員高度表達于神經干細胞中(Hes1和Hes5)[4],是Notch通路的靶基因。Hes1和Hes5在早期發育的腦中的異位表達可抑制神經元的分化，維持干細胞數量。然而,在Hes1和Hes5雙敲除小鼠中,許多放射狀膠質細胞不能維持而提前分化為神經元。[7]Hes家族對于神經干細胞數量維持的重要性對于再生醫學有很大意義。亦有研究表明[6]，其對細胞干性也具有影響。

小鼠模型中[7]，Mash-1在胚胎發育極早期有表達,其表達局限在發育中的神經系統中。Mash-1可以對哺乳動物自主神經、嗅神經視網膜以及端腦神經元產生調控。Mash-1與Hes1共表達時,存在能夠促進GABA能神經元形成特定情況,但無論Hes1還是Mash-1單獨表達則不會產生上述情況。

Hes1的過表達可以抑制Mash-1的轉錄。Hes因子作用的靶基因包含激活型的Mash-1[4]。通過直接結合到啟動子部位而抑制Mash-1基因的表達。因為激活型的bHLH因子可與另一個bHLH激活物E47形成異源二聚體，由此促進向神經元的分化，而Hes1可與E47形成一個非功能性的異源二聚體而抑制正常異源二聚體的形成[8]。綜上所述，Hes1通過兩個不同的機制而拮抗Mash-1的功能轉錄水平抑制它的表達，蛋白與蛋白相互作用的水平抑制其活性。

4 Mash-1基因表達對神經干細胞分化發育和神經發生的作用

在ESC維持全能性時，Mash-1基因的轉錄受到抑制；一旦神經分化發生，Mash-1基因的轉錄則被上調。敲除Mash-1基因可導致神經發育不全或特定神經元亞型的缺失[9]。

4.1 對干細胞分化發育的積極作用 研究表明[10]，在ESC分化過程中，Hes1基因無明顯變化，而Mash-1在分化的細胞中表達，證明了Mash-1在神經發育中具有很大作用，其表達影響待分化干細胞的細胞命運，對干細胞維持是消極因素。

GDNF和IL-1α聯合作用可誘導NSCs以較高的比例水平分化成為多巴胺能神經元。熒光定量PCR得出Mash-1基因在分化開始后表達上升，隨時間延長表達升高，以實驗組尤為顯著，Hes1于分化后明顯降低，但時長上間比較無顯著性差異[6,10]。這一結果即，分化開始后Hes1基因表達降低，減少了與E47的結合，對Mash-1的競爭性抑制作用由此降低，NSCs向多巴胺能神經元分化則受到了促進。同時Mash-1基因的表達可能在細胞因子的誘導作用下隨著分化的進程逐步升高，進一步的加強對NSCs的分的促進作用[11]。

谷氨酸能與GABA能的分化是神經元分化過程中與神經發生一起出現的精細調整過程。這個過程可以通過多種因素調節或選擇，包括Mash-1在內的神經元基因和(或)同源域轉錄因子[13]。有絲分裂調節因子在谷氨酸能與GABA能分化中的作用很大，可能具有同Mash-1交互的作用。這些過程背后的因素是不同的[10]，并且可能會在不同的大腦區域有所不同。遺憾的是，在神經系統的不同區域具有不同機制的優點尚不太了解。

另有研究表明[13]，移植的神經干細胞可分化為神經元和星形膠質細胞，并在小鼠PSC中表現出典型的興奮性和突觸反應?？纱_定EE和Mash-1轉導顯著影響移植的NSCs向神經元的分化，并抑制NSC分化為神經膠質細胞和抑制性神經元[12]。此外，神經決定基因NeuroD的表達與Mash-1表達正性相關[13]，Mash-1起促進表達的作用。bHLH轉錄因子Mash-1和Ngn2與神經元分化和NSC存活相關。因此，研究了Mash-1和Ngn2轉導對NSCs移植到完整體感皮層的命運的影響，結果表明[13]，Mash-1和Ngn2轉導的NPCs在成人受體體感皮層移植后增強了成熟神經元分化并抑制了體內的膠質分化(盡管該研究中實驗組和對照組之間的差異僅在Mash-1轉導的NPC中達到顯著性)。

另外有報道[14]在誘導Mash-1表達后，體外培養的NPC向神經元分化顯著增強。表達Mash-1的移植NPC在成年大鼠大腦中產生大的移植物，移植Ngn2轉導的NPC也增強了神經元產量和供體細胞存活[15]。有研究發現逆轉錄病毒介導的bHLH轉錄因子Ascl1(Mash-1)的過度表達改變了增殖的成體海馬干/祖細胞后代的命運，從而導致以犧牲新生神經元為代價的少突神經細胞系的排他性生成[16]。而Mash-1誘導的神經球培養系統中體外抑制性神經元的分化也歸因于bHLH轉錄因子之間的補償和交叉調節機制[17]。

4.2 中樞神經系統的影響 在中樞發育層面，Mash-1在腹側端腦和腹側雙眼蛛內的特定區域中以高水平表達。在沒有Mash-1的情況下，這些前腦區域內的組織形態、增殖和基因表達被破壞[18-19]。Mash-1對腹側前腦結構正常發育是必須的[12]。先前的研究已經表明，基因Mash-1的小鼠突變體在自主神經系統的嗅覺上皮和神經節中顯示嚴重的神經元損失，表明Mash-1在周圍神經系統中神經元譜系的發育中發揮作用。Mash-1突變小鼠呈現嚴重的祖細胞丟失，尤其是內側神經節隆起的室下區中的神經元前體。隨后隨發育失去基底神經節和大腦皮層的離散神經元群體。對Mash-1功能的候選效應子的分析揭示Notch配體Dll1和Dll3以及Notch信號傳導Hes5的靶標不能在Mash-1突變腹側端腦中表達[18]。因此，Mash-1是腹側端腦神經發生的重要調節因子，它需要既指定神經元前體又控制其產生的時間。

4.3 周圍神經系統的影響 在周圍神經系統中的研究表明[20]，Mash-1具有促進神經嵴細胞(Neural crest stem cell，NCSC)分化為自主神經元的關鍵功能。NCSC在體外培養時，加有誘導性生長因子會導致特異性細胞系產生，可以表現為BMP2上調Mash-1的表達促進自主類神經發生[21]。近年有大量研究指出[22-23]，Mash-1過表達有助于神經再生修復。采用鼠干細胞病毒將Mash-1基因轉染CE3小鼠胚胎干細胞穩轉株的實驗證明了過表達Mash-1基因可促進CE3細胞在脊髓損傷部位分化成神經元，可促進脊髓損傷的修復[22]。

5 展 望

臨床層面上，研究[24]指明Mash-1也在腫瘤和中樞疾病中有影響。而這些機制有待進一步詳細考證。中樞低通氣綜合征(CCHS)和哈達德(Haddad)綜合征已被證實與Mash-1相關[25]。作為新生兒，Mash-1 (+/-)雜合子小鼠表現出對高碳酸血癥的呼吸機反應受損。Mash-1的人直系同源基因已被作為CCHS的候選基因進行了研究[26]。2例CCHS患者(10.5%，2/19)和1例Haddad綜合征患者(9.1%，1/11)發現HASH-1突變[27]。這與神經發生的過程是否具有聯系還尚無定論?！禖ell》雜志的一篇文章指出：“Achaete-scute復合體1(Ascl1/Mash1)作為啟動神經重新編程的轉錄因子。它促使神經祖細胞和非神經元細胞退出細胞周期，并通過激活神經靶基因促進神經分化，即使是那些通常被抑制的基因[28]。”雖然有很多值得注意的地方，但Ascl1的外源性過表達，單獨或結合其他因素，作為一種治療腦損傷和癌癥的方法，可能值得進一步考慮。而在神經退行性疾病中bHLH家族的神經再生意義也是未來的探討方向之一[29]。

神經組織再生能力的研究已超過一個世紀。在神經生物學中，對神經干細胞自我更新和分化調控機制的研究更有意義。目前已經了解包括Mash-1在內的有多種分子機制參與神經干細胞的自我更新和分化調控，包括轉錄因子、表觀遺傳、miRNA調控子和細胞外信號等[21]。這些細胞內在基因表達和外界環境因素構成復雜的調控網絡，共同調節神經干細胞的自我更新和分化?，F在神經干細胞的臨床研究還處于起步階段，對于其基因分子水平的研究以及對再生醫學臨床化還存在很多問題[21]。Mash-1基因表達水平在干細胞分化與維持波動和其意義還有待詳細探討。