RNA甲基化在中樞神經系統作用中的研究進展

鄧宇，杜先超

（中國醫科大學公共衛生學院環境衛生學教研室，遼寧 沈陽110122）

近年來，在DNA和蛋白質修飾基礎上，表觀轉錄組學（epitranscriptomics），又稱“RNA表觀遺傳學”，成為近期的研究熱點。表觀遺傳是在DNA序列保持不變的情況下調節基因的表達，最終導致可遺傳的基因表達水平的改變，對維持染色體結構的穩定性起著重要作用［1］。表觀遺傳包括組蛋白共價修飾（covalent histone modification）、DNA甲 基 化 修 飾（DNA methylation）、RNA甲 基化修飾（RNA methylation）、基因組印記（genomic imprinting）、基因沉默（gene silencing）、RNA編輯（RNA editing）及非編碼RNA（noncoding RNA）等，這些在胚胎和成體神經發生中起著至關重要的作用［2］。RNA作為中心法則的關鍵中間環節，是遺傳物質DNA和蛋白質在生命活動中的紐帶，而細胞內的RNA存在100多種不同的化學修飾，最常見的是N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A），此外還有5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）、1-甲基腺嘌呤（1-methyladenosine，m1A）、5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，hm5C）、假尿嘧啶（ψ）等，這些修飾在細胞內行使不同的生物學功能［3-4］。可逆RNA甲基化修飾研究引領了第3次表觀遺傳修飾研究的浪潮。研究發現RNA甲基化修飾在中樞神經系統發育過程中發揮了重要作用［5］。本文將從RNA甲基化調節神經元、膠質細胞、神經干細胞（NSCs）和突觸的發育等幾個方面展開論述。

1 RNA甲基化的概述

早在20世紀70年代RNA甲基化就已經被發現［6］，其廣泛分布于mRNA、tRNA、rRNA、snRNA以及snoRNA［7］。這種修飾主要在后轉錄階段發生于氮原子和氧原子上，與DNA甲基化類似，利用S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供的甲基供體，在各種甲基化酶的催化作用下完成修飾的全過程［8］。其中最具代表性的兩種修飾是m6A和m5C，研究這兩種修飾在中樞神經系統發育中的作用至關重要。隨著酶學技術的發展，m6A的修飾酶相繼被發現，其中WT1相關蛋白（WT1 associated protein，WTAP）、甲 基 轉 移 酶 樣 蛋 白3（methyltransferase like 3，METTL3）、甲基轉移酶樣蛋白14（methyltransferase like 14，METTL14）和KIAA1429等4種蛋白復合物作為甲基轉移酶催化m6A的形成；而肥胖相關蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）和α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶AlkB同源蛋白5（AlkB homolog 5，ALKBH5）可使m6A去甲基化；m6A修飾的生物學功能可能主要通過包含有YTH結構域的結合蛋白來發揮，包括YTH結構域包含蛋白1（YTH domain-containing protein 1，YTHDC1）、YTH結構域包含蛋白2（YTH domain-containing protein 2，YTHDC2）、YTH結構域家庭蛋白1/2/3（YTH domain-containing family protein 1/2/3，YTHDF1/2/3）［9］。m5C修飾主要在mRNA和tRNA中存在，目前已發現3種甲基轉移酶：NSUN2、NSUN4和Dnmt2，然而尚無去甲基化酶的發現［10-11］。相對于DNA甲基化，RNA甲基化更加復雜、種類更加繁多，并且參與調節許多生物學過程，這就決定了RNA的轉錄后修飾功能的多樣化。研究RNA甲基化修飾在正常生理狀態下對神經活動和大腦功能的調控有助于更好地理解其在中樞神經系統中的作用。

2 RNA甲基化在中樞神經系統發育中的作用

神經發生是從NSCs的神經元命運特征開始的。為了正常運行，新神經元必須整合到適當的神經網絡中，并與其他神經元建立正確的通信［12-13］?；瘜W修飾的動態過程是神經系統功能的典型特征，表觀轉錄組之一的RNA甲基化在成熟神經元的形成、NSCs分化及自我更新過程中發揮重要作用［14］。類似于DNA和蛋白質的化學修飾，RNA修飾對細胞的功能意義是巨大的。

2.1 RNA甲基化修飾m6A在中樞神經系統發育中的作用

2.1.1 m6A去甲基化酶在中樞神經系統發育中的作用 m6A修飾在神經系統的發育及功能的行使中發揮不可替代的調控作用［15-17］。腦區是中樞神經系統必不可少的部分，而小腦是在出生后2周發育［18］，在這個過程中整個轉錄組范圍的m6A甲基化分析描繪了腦的空間特異性甲基化譜，并揭示m6A在小鼠小腦中的甲基化水平高于大腦皮層［19］，表明m6A在該腦區域中的關鍵作用。m6A甲基轉移酶和去甲基化酶的分子特征對于我們理解中樞神經系統中的m6A特征是必不可少的，m6A去甲基化酶FTO在大腦皮層的表達量最多，并在成熟的NSCs和神經元高表達［14］；有研究證明FTO的缺失導致成人神經發生和認知能力受損［20］。FTO在大腦中的高度表達，表明它可能通過改變調節神經相關基因功能表達的m6A RNA甲基化而在神經系統中發揮作用。m6A甲基化與去甲基化的動態過程貫穿于小鼠小腦出生后發育的整個過程，且在低壓低氧環境下AL K B H5基因缺失造成參與小腦發育調控進程基因的m6A水平紊亂，加快了RNA出核過程，從而導致小腦發育明顯滯后，同時，AL K B H5基因缺失通過擾亂不同細胞命運決定基因中RNA m6A甲基化的平衡而導致小腦中異常細胞增殖和分化來影響正常的小腦發育［21］。也有研究發現ALKBH5通過改變m6A水平調控了小鼠小腦中特定類型RNA的出核而影響了小腦發育［22］。目前關于去甲基化酶在中樞神經系統作用中的研究僅局限于部分腦區，沒有在其他腦區進行研究論證，不排除這兩種酶在其他腦區的表達變化會影響腦部發育，希望后續研究可以填補這一空白，并為神經發育在表觀轉錄方面提供新的視角。

2.1.2 m6A甲基化酶在中樞神經系統發育中的作用 已有研究表明，常規敲除小鼠中的M ET T L3基因可導致早期的胚胎致死［23］。為了探究m6A甲基化修飾對中樞神經系統發育的影響，研究者對發育中小鼠腦中M E TTL3基因進行條件性敲除，在皮質和小腦區域均引起嚴重的發育缺陷，進一步研究發現，M ET T L3基因敲除的小鼠表現出小腦發育不全，其原因是外部顆粒層（EGL）中新生小腦顆粒細胞（CGC）的細胞凋亡急劇增加；METTL3失活誘導的m6A修飾缺失導致RNA半衰期的延長和異常的mRNA剪接，從而導致了不適當的細胞分化和細胞死亡，并且使轉錄組基因表達失調和CGC過早死亡；這表明METTL3介導的m6A轉錄后水平在哺乳動物小腦發育中起著關鍵調節作用［24-25］。同時，在小鼠的中樞神經系統中敲除M ET T L14基因也會嚴重影響小鼠大腦皮質的發育［26］。據此，RNA甲基化修飾m6A在中樞神經系統發育過程中發揮的作用不容忽視。

2.1.3 m6A識別蛋白在中樞神經系統發育中的作用 神經突向外生長是神經元發育和成熟、突觸形成、神經功能和疾病功能恢復的關鍵，對神經突分支和YTHDF2-/-神經元延伸的嚴重影響也可能導致神經發育過程中神經發生缺陷［27］。RNA甲基化修飾m6A的結合蛋白YTHDF2也參與中樞神經系統發育的調節作用。Li等［28］研究發現，m6A結合蛋白YTHDF2通過促進神經發育相關mRNA靶標的m6A依賴性降解來調節神經發育。有研究發現，m6A甲基轉移酶METTL14或m6A結合蛋白YTHDF1通過調節損傷誘導的蛋白質翻譯來調節外周神經系統的功能性軸突再生［26］。隨著研究的深入，有研究發現了m6A甲基化在哺乳動物皮質神經發生的時間進程和調節成年哺乳動物神經系統軸突再生中的作用［17，26］。綜上所述可見，RNA甲基化修飾m6A在中樞神經系統發育的過程中發揮著關鍵作用。

2.2 RNA甲基化修飾m5C在中樞神經系統發育中的作用 RNA甲基化修飾m5C在中樞神經系統發育中的作用研究雖然沒有m6A的研究廣泛，但也有研究報道m5C的甲基轉移酶NSUN2也參與神經發育的調節。在人類中，抑制NSUN2的表達可以抑制神經遷移，并且在血管生成素存在下會干擾人類NSCs的神經分化進而損害神經譜系，因此，m5C RNA甲基化途徑是對神經譜系誘導刺激的有效細胞反應所必需的［29］。Blanco等［30］研究報道了小鼠和人類N SU N2基因的功能喪失均會導致包括小頭畸形，以及認知和運動功能缺陷的生長遲緩和神經發育缺陷。為了解NSUN2及其甲基化RNA靶標如何干擾神經分化途徑，在前腦發育的所有RNA中鑒定了所有NSUN2依賴性m5C［31］，證明甲基轉移酶NSUN2在甲基化修飾過程中參與中樞神經的發育調節。但尚未見其他m5C的甲基轉移酶對中樞神經系統的發育有調節作用，在這一方面還需進一步的研究和論證。由于RNA甲基化修飾m5C的局限性和其研究的特殊性，對其在中樞神經系統發育過程的調節作用還有待進一步研究證實，縱觀表觀轉錄組學在中樞神經系統功能研究，不難得出m5C修飾的作用也不可小覷，相信在以后的研究中還會有新的發現。

3 RNA甲基化在神經細胞發育過程中的作用

NSCs是具有自我更新功能的多能細胞，是中樞神經系統的主要部分，其生態位位于側腦室下區基部的內皮細胞以及海馬齒狀回顆粒下區［32］，而發育中的CGC祖細胞在EGL中增殖，然后通過分子層遷移至內部顆粒層以分化成顆粒細胞，產生平行纖維并與浦肯野細胞形成突觸連接［18，33］。而在整個神經系統發育過程中NSCs的維持和分化受到錯綜復雜的表觀轉錄分子網絡調控，揭示這些機制對于了解成人大腦的功能和可塑性至關重要。

3.1 RNA甲基化修飾m6A在神經細胞發育過程中的作用 RNA甲基化修飾m6A在神經元功能和生理學中的功能特征仍處于初期階段，在哺乳動物神經系統中，m6A調節已經在幾種生理功能中得到證實，包括神經發育和突觸可塑性，以及成癮、神經損傷和應激反應等［14，34-35］，由此可見，m6A修飾在神經細胞的發育過程有著復雜的調節作用。

3.1.1 m6A去甲基化酶在神經細胞發育過程中的作用 Li等［16］研究結果表明FTO在神經細胞發育中起著重要作用，FTO的丟失降低了成人神經干細胞（adult neural stem cells，aNSCs）的分化，確定了FTO在神經細胞分化中的作用。腦源性神經 營 養 因 子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）是提高神經元存活和可塑性的重要調控因子，在神經元發育中起重要作用，FTO調節BDNF的表達并且發現BDNF信號傳導途徑的幾種組分的m6A修飾標記的轉錄物［36-40］，說明RNA去甲基化酶FTO參與神經元的調控。同時也有研究表明FTO的缺乏可以減少aNSCs的增殖和神經元的分化，從而導致學習記憶的受損，說明通過FTO調節m6A的修飾而改變基因表達進而在神經發生以及學習記憶中起重要作用［34］。目前尚未發現其他去甲基化酶在中樞神經細胞發育過程的調控作用。

3.1.2 m6A甲基化酶在神經細胞發育過程中的作用 有研究發現，m6A甲基轉移酶也參與調節神經元、NSCs的發育。在小鼠胚胎中，通過敲除NSCs中METT L14的表達而使m6A缺失，可導致細胞周期進展延長和分化延遲，從而將皮質神經發生延伸到出生后階段，盡管它們在NSCs中早期表達，m6A似乎也負責抑制神經元譜系基因（Neuro g2、Neurod 1、Neurod2）［41］。此外，敲除胚胎小鼠腦中ME TT L14基因致使m6A的缺失，從而延長了放射狀膠質細胞的細胞周期，并將皮質神經發生延伸到出生后階段，同時敲低M ET TL3基因致使m6A減少也可導致細胞周期延長和放射狀神經膠質細胞的分化［26］。METTL14缺失導致體內胚胎小鼠皮質和培養的皮質神經祖細胞（NPC）中mRNA的m6A水平顯著降低，通過有條件地滅活胚胎NSCs中的METTL14，發現METTL14是NSCs增殖所必需的并且維持NSCs處于未分化狀態，這些結果表明m6A mRNA甲基化在調節小鼠和人的皮質NPC細胞周期進程中起保守作用［26］。通過調節mRNA衰變，外源轉錄m6A標記為動態基因表達的時間控制提供了關鍵機制，其反過來調節小鼠和人的皮質NSCs的細胞周期進程。同時還證實了，m6A通過調節組蛋白修飾物的mRNA穩定性改變組蛋白修飾，改變組蛋白修飾異常抑制增殖相關基因并激活分化相關基因，導致NSCs基態喪失?？傊?，通過促進與轉錄因子、NSCs、細胞周期和神經元分化相關的轉錄物的mRNA衰變，確定了m6A表位轉錄機制在哺乳動物皮質神經發生的時間控制中的關鍵和保守作用［26］。

3.1.3 m6A識別蛋白YTHDF2在神經細胞發育過程中的作用 YTHDF2缺失對皮質發生、神經發生和膠質細胞生成具有嚴重影響；YTHDF2通過調節與神經發育和分化相關的m6A標記基因的RNA降解，在胚胎神經發育過程中發揮關鍵功能。Li等［28］研究發現，NSCs自我更新和神經元和其他細胞類型的時空生成受胚胎新皮質中YTHDF2缺失的影響，YTHDF2敲除的小鼠NSCs的增殖和分化顯著降低；神經元不能產生正常的神經突，不能分化為神經膠質細胞；神經元分化相關的m6A修飾的mRNA延遲降解，導致延遲的皮質神經發生。

3.2 RNA甲基化修飾m5C在神經細胞發育過程中的作用 RNA甲基化m5C修飾的甲基轉移酶NSUN2也發揮著神經細胞發育調節的作用。在發育中的小鼠腦中，NSUN2的缺失不會影響放射狀膠質細胞，但會延遲分化為上層神經元，NSUN2在早期神經外胚層細胞中表達，其能夠分化成各種區域特異性神經元和神經膠質細胞類型［42-43］?？傊琋SUN2的缺失通過減少皮質板中分化的上層神經元的數量而損害正常的大腦發育。RNA甲基化修飾m5C的研究沒有m6A修飾研究廣泛，僅有少量的文獻證明m5C參與中樞神經細胞發育的調節。

4 RNA甲基化調節突觸的形成參與學習記憶

雖然RNA甲基化修飾的種類繁多，廣泛的研究僅集中在m6A和m5C兩種修飾，但是關于RNA甲基化調節突觸的形成參與學習記憶方面僅有m6A修飾發揮作用的研究，而尚未發現其他甲基化修飾在該過程中的調節作用。體外細胞實驗和體內實驗證明神經元中的FTO蛋白可以在細胞核、細胞體和樹突（包括突觸）之間穿梭，并且能夠導致局部RNA甲基化動力學改變［19-20］。甲基化轉錄物高度偏向于神經元基因和功能，例如突觸功能；m6A的轉錄組譜在不同的腦區被空間調節。在單個神經元的水平上，m6A修飾的RNA及其相互作用組擴散到特定結構，如軸突、樹突、突觸前神經末梢和樹突棘。這種空間分布支持m6A的功能庫控制突觸傳遞和可塑性。m6A-表型轉錄組中的動態變化以依賴于經驗的方式為m6A功能在形成中樞神經系統的轉錄組學中提供了基礎。哺乳動物腦中m6A的轉錄組學分析揭示了m6A對神經元的特定偏向，而不是神經膠質細胞基因，m6A-seq分析在整個小鼠腦、中腦、皮質和小腦中的功能分類已經鑒定出m6A靶基因，其中大多數參與神經系統發育、突觸傳遞和突觸后功能。這些基因具有不同的細胞作用，特別是在轉錄調節、RNA代謝和細胞內信號級聯中的作用顯著［34，44-45］。突觸體mRNA的m6A-seq分析表明，m6A主要在遠端突觸前和突觸后區室中分布［46］，大多數m6A靶基因參與功能性表達包括“突觸”和“細胞連接”，以及表面受體途徑等；所有這些基因都維持三聯突觸的完整性和功能性，包括突觸前和突觸后終端，以及它們與星形膠質細胞的相互作用［15］。還有研究報道了m6A在軸突中的定位及其在軸突生長中的作用，編碼軸突延伸因子GAP-43的轉錄物被鑒定為mRNA靶標，是軸突生長中起重要作用的m6A修飾轉錄物之一，其局部翻譯被m6A負調節并且可以通過軸突中的FTO調節［15，47］，可見RNA甲基化修飾在神經突觸的發育及功能中也發揮著重要作用。FMRP是神經元局部翻譯的重要調節因子，可與含有m6A的mRNA體內結合，FMRP因其在代謝型谷氨酸受體（mGluRs）依賴性信號傳導和突觸可塑性中的作用而被充分研究［48］。FMRP和YTHDF1在m6A修飾的mRNA子集上的競爭性結合可能影響轉錄物的翻譯速率進而影響突觸可塑性［49］。也有研究發現在正常生理條件下，FMRP通過維持和調節關鍵突觸蛋白（包括CaMKII、PSD95和谷氨酸受體亞基）的翻譯在突觸可塑性中起重要作用，也通過阻止核糖體延長或通過其與miRNA和RNA誘導的沉默復合物的相互作用反饋調節樹突mRNA子集的翻譯［50-51］。

抑制FTO導致小鼠背根神經節神經元中m6A增加也導致軸突長度變短，這表明平衡的m6A標記對于最佳軸突生長非常重要［16］。有研究發現，F TO基因敲除小鼠在空間學習中表現出障礙，證明了m6A可能在記憶鞏固過程中微調轉錄組學反應，并且觀察到可塑性相關轉錄本的m6A標記普遍增加［35］。雖然許多研究表明DNA修飾（DNA甲基化、組蛋白修飾）在記憶形成中發揮重要作用，但RNA修飾的貢獻仍然很大程度上未被探索。有研究證實了FTO在細胞體內以及在突觸脊附近的存在，表達模式也與FTO在突觸可塑性和記憶形成中重要的觀點一致，同時還發現了FTO存在于突觸附近，突觸細胞膜成分中FTO的優先減少暗示了突觸中甲基化mRNA增加對于記憶形成的重要性；并且提供直接證據表明在訓練前（使用兩種獨立方法）在興奮性CA1神經元中特異性地去除FTO足以增強情感恐懼記憶［35］?？傊@些發現表明FTO，特別是在突觸附近，通常可以限制記憶形成。此外，這些結果清楚地表明mRNA甲基化是神經可塑性的關鍵調節劑。解釋FTO如何影響記憶形成的最簡單模型是FTO抑制突觸的前記憶轉錄物，可能通過抑制樹突狀定位mRNA的翻譯［35，45］。在突觸核區與核區室中區分FTO靶標的單個基因或位點對于釋放記憶形成中mRNA甲基化的特定功能至關重要。最近一項研究表明腦內神經元中甲基轉移酶METTL3或去甲基化酶FTO的缺失改變了m6A/m表觀轉錄組，增加了恐懼記憶，并改變了對恐懼和突觸可塑性的轉錄組反應［52］。也有研究者通過敲除小鼠內側前額葉皮層（mPFC）中的m6A去甲基化酶FTO，使其增加總m6A水平，導致恐懼記憶的強化鞏固，并證明了m6A在成年大腦中以活動依賴性方式受到調節，并且可能在記憶相關過程中微調mRNA轉換［53］。以上的研究表明RNA甲基化修飾過程在神經突觸的發生以及功能調節作用顯著，進而在學習記憶過程中的調節也扮演著重要角色，同時通過對其調節機制進一步研究，為后續神經系統疾病以及學習記憶障礙等的防治提供理論基礎和科學依據。

綜上所述，隨著RNA表觀轉錄組學研究的深入，尤其對RNA甲基化修飾的研究開始兼顧與疾病關聯性，因此研究RNA甲基化在神經系統發育中的作用和機制有利于理解相關疾病的發生機制，對神經退行性疾病的預防與治療會有很大的幫助。同時隨著研究的進展，RNA甲基化在中樞神經系統發育中的作用將會被人類所闡明。目前，大量的研究都集中在m6A的RNA甲基化修飾在中樞神經系統發育中的作用，而m5C的RNA甲基化修飾等其他的修飾在中樞神經系統發育中的作用研究的還比較局限，在調節機制上還沒有明確的研究報道，還需要進一步研究去揭示出新的調節機制。相信未來新興技術的發展將會有效推動RNA甲基化修飾在中樞神經系統發育中的調節作用，為后續中樞神經系統疾病的預防和治療提供更好的解決手段。