EMS 誘變技術及其在小麥研究中的應用進展

李 雪，裴自友，溫輝芹，程天靈，張立生，朱 玫，王宏兵

（1.山西省農業科學院作物科學研究所，山西太原030031；2.農業部黃土高原作物基因資源與種質創制重點實驗室，山西太原030031）

化學誘變技術是利用化學物質使物種發生基因突變，這些化學物質即為化學誘變劑。化學誘變劑分為烷化劑、堿基類似物及嵌入劑。烷化劑甲基磺酸乙酯（EMS）是目前應用最廣泛、效果最好的一種誘變劑，其產生點突變的頻率較高，染色體畸變相對較少，對生物破壞性小，是目前最為有效的植物化學誘變技術方法之一。EMS 可以對作物的某一種特殊性狀進行改良，對培育作物新品種和獲得特異種質資源具有重要意義。目前，EMS 誘變技術的應用主要集中在小麥、玉米等作物育種上。

筆者就我國在小麥EMS 誘變與鑒定、突變體庫構建及其利用等方面的研究進展進行了綜述，以期為今后的誘變育種提供參考。

1 小麥EMS 誘變與鑒定

通常利用植物干種子進行EMS 誘變，也可對愈傷組織等進行誘變處理。采用的誘變方法主要有浸泡法、滴液法、共培養法[1]。不同EMS 處理濃度對植物誘變影響不同，從而可以得到誘導不同部位、不同農藝性狀突變的最佳EMS 濃度。薛芳等[2]在對新春11 小麥的抗性淀粉誘變研究中發現，0.3%是最適宜新春11 小麥的農藝性狀突變的濃度。張維宏等[3]研究發現，當EMS 濃度為0.8%或1.0%時，處理8 h 后，幼苗接近半致死，為突變體篩選的最佳劑量。王國芬等[4]研究發現，pH 值為7.0，使用0.3 mol/L的EMS 處理小麥條銹菌條中27 號小種夏孢子6～8 min，達到微生物誘變最佳劑量。丁延慶等[5]分別用0.4%，0.6%，0.8%濃度的EMS 處理小麥品種貴協9 號發現，誘變的最適宜濃度為0.4%，濃度越高種子和幼苗的致死或畸變率越高。李曉等[6]以京411突變群體為材料，用TILLING 技術檢測創建突變體，結果顯示，8，4 h 處理最佳誘變效率的EMS 濃度分別為0.9%和1.5%。程志鋒等[7]利用復合誘變技術對小麥抗葉銹近等基因系利用60Co γ 射線照射和EMS 處理，結果表明突變體最佳誘變組合是0.4%的EMS 和0.15 KGy 的60Co γ 照射。

小麥EMS 突變體的鑒定方法有表型、生理生化、分子標記，其中，基因組靶向定位誘導損傷技術（Targeting Induced Local Lesions in Genomes，TILLING）是在化學誘變和PCR 定向篩選基礎上發展起來的檢測點突變的反向遺傳學研究方法，具有高通量、低成本、不依賴于基因型等特點，已在多種植物中得到了應用，促進了誘變育種的發展[8]。

2 突變體庫構建與關鍵性狀突變體篩選

2.1 產量性狀突變體

通過EMS 化學誘變盛農1 號[9]、山農666-2[10]、山農861[10]、山農1186[11]、京411[6]、國麥301[12-13]、偃展1 號[14]、新春11 號[2]、豫農201[15]、偃展4110[16]、河農822[17]和煙農15[18]等品種（系），分別獲得了分蘗、株高、穗部、葉部、莖部、育性、成熟期、籽粒等性狀的突變系。突變頻率因品種和處理的不同而不同，上述各性狀的突變率依次為0.18%～0.63%，0.9%～46.2%，0.2%～25.17%，0.89%～2.2%，0.49%～17.48%，0.27%～2.25%，0.27%～9.09%和0.04%～10.49%，其中，株高和葉部突變較易發生。有利性狀突變有矮稈、早熟、大粒、多蘗等性狀，南京農業大學細胞遺傳研究所利用EMS 處理蘇麥3 號和南農9918 干種子，獲得矮稈蘇麥3 號和矮稈寧麥9 號突變系，并將其矮稈基因分別定名為Rht23[19]和Rht_NM9[20]。

2.2 品質性狀突變體

李曉等[6]通過TILLING 技術檢測Wx-A1 基因突變，在M2獲得了4 個可穩定遺傳的WX-A1 突變系，其直鏈淀粉含量下降2.8%～7.4%。張紀元等[21]創建了寧麥9 號不同高分子量谷蛋白亞突變系，發現在M1HMW-GS 缺失突變頻率為4.65%，缺失亞基涉及Ax1，Bx7，By8，Dx2 和Dy12，突變頻率為0.24%～3.28%；在M3獲得Ax1，Dx2，Bx7，By8 和Dy12 缺失突變體，及Ax1＋By8 雙缺失突變體。同樣，在豫農201 和河農822 突變體中，篩選到缺失不同類型亞基的突變體。EMS 誘變對小麥淀粉理化特性的影響研究表明，EMS 處理后濟麥20、濟麥22 誘變材料糊化黏變異度系數分別為12.25%～25.48%和30.92%～40.61%；濟麥22 誘變材料直鏈淀粉含量較未誘變材料明顯有所下降，而濟麥20 無明顯變化；濟麥22 誘變材料抗性淀粉含量明顯高于濟麥20[22]。在經0.7%EMS 處理獲得新春11 誘變后代中，也獲得豐富的高抗性淀粉含量的突變體[2]。柳學余等[23]利用γ 射線、微波與EMS 復合處理改良小麥品質，獲得了高蛋白、高面筋和高賴氨酸突變體。

2.3 抗逆性突變體

在抗旱性篩選試驗中，王瑾等[24]分別對抗旱性差的小麥品種溫麥6 號和周麥17 進行花藥愈傷組織及幼胚愈傷組織EMS 處理，將再生植株接種到PEG 濃度為80 g/L 的生根培養基中，經過抗旱篩選，抗旱植株有13 株，平均變異率為5.8%。

2.4 感病突變體

利用EMS 處理攜帶Pm21 基因的高抗白粉病小麥品種南農9918，經多代白粉病鑒定，獲得了一個遺傳穩定、全生育期感白粉病的單位點隱性突變材料NM14，其對所有檢測的23 個生理小種都表現感病性，其中，18 個達到最高感病級別[25]。張維宏等[3]用EMS 處理小麥抗葉銹病近等基因系TcLr19種子，獲得M36-2，M333-8，M333-9，M333-11，M344-4，M396-8 等6 個M3感葉銹病突變材料。李韜等[26]從高抗赤霉病小麥地方品種黃方柱和海鹽種的突變后代中，篩選到F6，F9，F12，Y6，Y7 和Y9 等6 個突變體，其病小穗率均顯著高于相應野生型，均達到中感及高感水平，這6 個突變體材料成為日后研究赤霉病擴展抗性的理想材料。通過對抗黃矮病的小麥- 中間偃麥草易位系YW642 的誘變，陳洋等[27]篩選到18 個可以遺傳的感黃矮病突變體，為抗黃矮病基因Bdv2 的克隆和功能基因組學研究奠定了材料基礎。

2.5 抗病突變體

施巾幗等[28]研究表明，EMS 為小麥白粉病抗性基因的有效誘變劑，EMS 的適宜處理濃度為0.3%左右，試驗中3 個小麥品種（原冬3 號、京冬6 號及農大142）平均抗白粉病突變體出現頻率為0.33%，高于γ 射線（0.27%），低于電子束（0.46%）和NaN3（0.56%）處理的突變頻率。

2.6 誘導小麥條銹菌毒性突變

王國芬等[4]根據不同處理緩沖液的pH 值，對小麥條銹菌夏孢子萌發率的誘變條件進行優化，確定其最佳誘變劑量。利用EMS 處理小麥條銹菌CY17和CY31 的夏孢子誘發其毒性突變，用抗條銹Yr 近等基因系篩選毒性突變體，獲得了4 個CY17 突變菌株和1 個CY31 突變菌株，突變率在2.14×10-6～3.68×10-5，各品種病菌突變頻率差異顯著。對突變菌株毒性測定結果表明，CY17 的所有突變菌株對Yr12 抗病基因表現出毒性增強，而CY17 和CY31 的所有突變菌株對Yr5，Yr10，Yr15 和Yr24等4 個抗病基因表現無毒性。研究證實，毒性突變是小麥條銹病菌毒性變異的重要途徑[29]。

2.7 創育小麥異源易位系

向普通小麥導入外源物種有益基因的最好方式是導入攜有目的基因的外源染色體片段（易位系），而且外源染色體片段越小越好。易位系可在遠緣雜交、回交等過程中自發產生，但頻率很低，也可通過組織培養、物理和化學誘變等方法來創制易位系[30]。敬樊等[31]通過EMS 處理高抗條銹病的小麥-華山新麥草二體異附加系種子，利用基因組原位雜交方法在930 個M2單株中共檢測出了61 個含有小麥- 華山新麥草易位染色體的單株，其中，20 個單株為小麥- 華山新麥草易位系，26 個單株為小麥- 華山新麥草易位- 易位附加系，易位頻率達6.56%；并確立1.0%EMS 處理為誘導小麥- 華山新麥草染色體易位的最適濃度。

3 突變庫的利用

WANG 等[32]對ms1e 突變體和野生型進行了全基因組重測序，各測了大概520 Gbp 的數據，然后mapping 至w7984 以及TGAC 基因組上，使用重測序獲得的標記最終將基因鎖定在198 kb 的物理區間內，該區間預測有9 個基因。進一步利用其他EMS突變體完成了MS1 基因的圖位克隆（PNAS-MS1）。小麥持綠突變體在衰老后期葉綠素基本不降解或降解很慢，且仍然保持較強的光合作用，能夠大幅提高生物量，WANG等[33]利用持綠性小麥突變體tasg1為材料的研究表明，細胞分裂素代謝改變在突變體tasg1 持綠變異過程中起著重要作用。同時，發現細胞分裂素與氮代謝相互作用、調控蔗糖代謝，進而調控突變體tasg1 生育后期延緩衰老的過程。特別是中國農業科學院作物科學研究所賈繼增等研究團隊在克隆與解析我國特有小麥太谷核不育基因Ms2 方面獲得突破性進展[34]，研究發現，該基因沒有保守的功能結構域，是僅存在于小麥族物種中的“孤兒”基因；Ms2 的產生經歷了一個比較復雜的進化過程；一個新的非自主型的TRIM反轉錄轉座子插入到Ms2 基因的啟動子區，激活了該基因并使其在花藥中特異表達，導致不育表型的產生。ZHANG 等[35]明確晚抽穗突變體m605（來自小麥偃展4110EMS 突變體庫）的抽穗期表型是由1 對隱性基因控制的，命名為TaHdm605，并將花期調控基因TaHdm605 精細定位于3DL 染色體1.86 Mb 的物理區間內。ZHANG 等[36]以高稈大粒突變體M8008 為材料，進行小麥籽粒大小和產量性狀的QTL 分析，籽粒性狀的QTL 在染色體2D 上分別形成1 個QTL 簇，SSR標記wmc41 主要與粒度性狀相關；wmc25-barc168區間的簇是與產量性狀相關。

研究人員利用RNAi，RNA-Seq 及TILLING 突變體篩選相結合的策略，對Psy1 調控面粉顏色的分子機制進行探索。ZHAI 等[37]研究表明，RNAi 轉基因植株籽粒Psy1 表達降低54%～76%，黃色素含量下降26%～35%，證明Psy1 對小麥籽粒黃色素合成有重要影響。次級代謝途徑和核心代謝途徑上的45 個候選基因構成復雜的調控網絡，協同響應Psy1 表達下調。天冬氨酸富集區（DXXXD）是Psy1重要功能結構域，其附近保守核苷酸通過調控基因表達、酶活性及選擇性剪接等影響黃色素合成?；ê?4 d 是小麥籽粒Psy1 表達調控的關鍵時期。

4 EMS 誘變技術研究利用展望

隨著小麥基因組的不斷完善，定位基因變得相對容易，小麥基因功能和調控機制研究越來越重要。目前來看，小麥遺傳轉化效率較低，因此，除了轉基因技術之外，利用突變體研究基因功能也是重要的手段之一。

反向遺傳學資源庫在二倍體模式生物的功能基因組研究中發揮著重要作用，但相關資源在多倍體材料中相對匱乏。普通小麥屬于異源六倍體，進化時間很短，A，B，D 三套亞基因組之間具有很高的相似性，存在功能冗余。很多有利的隱性突變性狀不容易表現出來，從而不能夠被自然或人工選擇[38]。六倍體小麥要想獲得目標基因在A，B，D 基因組中全部突變的材料，則需要進一步雜交和自交。同時，由于單個突變單株在整個基因組水平上均含有大量的突變位點，還必須將突變體與野生型材料進行雜交并連續回交，用來純化遺傳背景，以消除其他突變位點對目標性狀造成的影響。

小麥- 黑麥易位系T1BL·1RS 和小麥簇毛麥易位系T6AL·6VS 是小麥染色體變異的成功案例之一，由于這些易位系導致的重組率降低，在轉移親緣植物外源基因的同時，可以將小麥染色體上的有利組合傳遞下去，為育種家提供便捷的選擇途徑，加快育種進程[39]。隨著研究者的不斷深入探索，創建的小麥反向遺傳學資源庫-EMS 突變體將為小麥功能基因組學提供一個寶貴的遺傳資源，同時也為解析在人工或自然選擇中被忽略掉的隱性突變提供幫助，有利于改善小麥的營養品質、提高小麥籽粒大小或者用來尋找開花基因新的等位變異以提高小麥對環境變化的適應性等方面的研究。