生物膜在奶牛乳腺炎致病過程中作用

劉靜雨 耿俊俊 邢靜茹 劉文嬌 張曉建

（河南科技學院動物科技學院，河南新鄉 453003）

乳腺炎是奶牛業中最重要的疾病之一，不僅會損害動物健康和福利，并伴有產奶量下降、醫療保健成本增加、淘汰率較高，有時甚至死亡。流行病學研究發現，抗生素治療后的細菌學治愈率為0～80%，且高達40%的乳腺炎病例似乎是既往治療失敗的疾病，且發病可能性提高了4.8倍。先前研究人員已從血清蛋白結合、脂溶性抗菌劑的pKa值、藥效學和藥代動力學等方面討論了抗藥性問題，提出了一個假說：在包含葡萄球菌在內的多種微生物受感染組織中，微生物膜的生長，使細菌對幾乎所有抗生素產生了抗性。鑒于此，本綜述概述了與乳腺炎中細菌生物膜生長相關的機制，以期揭示細菌對幾乎所有抗生素的敏感性降低的原因，為奶牛乳腺炎有效防控提供理論依據。

1 生物膜

生物被膜是微生物有組織生長的聚集體。細菌不可逆的附著于惰性或活性實體的表面，繁殖、分化，并分泌一些多糖基質，將菌體群落包裹其中而形成的細菌聚集體膜狀物。人們研究認為皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌的細菌生物膜對抗生素和宿主免疫防御機制的抗性很強，而這些細菌大多也是牛乳腺炎的主要病原體，因此乳腺炎治療反復感染的困難可能與這些病原體形成生物膜的能力有關。

1.1 生物膜的形成與成熟

在自然環境中，微生物會嘗試粘附在可用表面上，并從一個表面擴散到另一個表面，這種表面運動性以及二元分裂導致附著細胞進一步聚集，而這些原代細胞聚集體產生胞外多糖以促進結塊。由此可見，生物膜形成的初始階段包括兩個階段：第一階段在細胞壁相關粘附素的作用下，細胞與天然聚合物表面的附著增加，粘附于表面。第二階段是通過細胞增殖形成由細胞外多糖相互連接的多細胞層成熟結構，葡萄球菌會產生糖萼，作為黏液層進一步保護細菌生物膜，但這些粘液層的化學性質仍未完全闡明。任何細菌生物膜的生長潛力均受到生物膜內細胞營養素的可用性和跨生物膜的獨特流通通道的限制。另外，pH值、氧氣灌注、碳納米管、來源和滲透壓也可影響生物膜成熟。當生物膜達到臨界質量時，進入動態平衡，最外層細胞層開始產生浮游生物，這些細菌可以自由逃脫生物膜并在其他表面定殖。

1.2 葡萄球菌產生的生物膜的表型和基因型基礎

研究發現，從葡萄球菌會產生的粘液層中純化出兩種多糖級分，多糖I（＞80%）為至少有130個?-1，6-N-乙酰氨基葡糖殘基的線性同聚糖，帶正電，多糖II（＜20%）的非N-乙酰化D-氨基葡萄糖殘基含量較低，并且含有磷酸鹽和酯連接的琥珀酸酯，多糖II為陰離子，結構獨特，在細胞簇形成中有一定的功能，被稱為多糖細胞間粘附素（PIA），金黃色葡萄球菌也有相同發現。值得注意的是，完整生物膜還有壁絨酸、葡萄球菌表面蛋白、聚集因子、積累相關蛋白和生物膜相關蛋白等其他組分[1]。

研究發現，表皮葡萄球菌0～47突變體存在兩種基因型，其中積累缺陷型突變體由于無法形成細胞間聚集，進而無法產生PIA和形成生物膜。另外，icaR基因的缺失增強了PIA表達，也說明該基因位點參與的PIA表達。編碼四個基因的ica操縱子存在于大多數金黃色葡萄球菌菌株中，而厭氧可以ica的表達，這也解釋了有氧條件下未能觀察到PIA產生（以及隨后生物膜生長）的原因。表皮葡萄球菌ica操縱子也受sigB操縱子控制，而金黃色葡萄球菌則受輔助基因調節劑（Agr）和葡萄球菌輔助調節劑（sar）的控制。這在一定程度上表明陽性細菌菌株生物膜比陰性菌株生物膜更與重大感染有關。

1.3 大腸桿菌和鏈球菌產生的生物膜的表型和基因型基礎

大腸桿菌的生物膜形成不僅受到生長培養基滲透壓增加的抑制，而且其生長強度也與rpoS基因有關，因為rpoS基因是受營養限制和有毒代謝產物的增加而表達的。盡管鏈球菌生物膜生長已得到廣泛研究，但是，就口腔鏈球菌而言，群體感應和雙組分系統在生物膜調節和生物膜的形成機制尚未被闡明。從大腸桿菌中篩選基因文庫表明，基因表達的主要改變可能與粘附和遷移有關。在惡臭假單胞菌中，附著后6小時內改變了30多個基因和40多個基因產物，在從浮游生長到銅綠假單胞菌生物膜完全成熟的過渡過程中，改變了800多種蛋白質的表達水平（相當于觀察到的蛋白質組的50%），表明該階段變異的復雜性。

2 生物膜對宿主免疫系統的抵抗力

形成生物膜的外聚合物可保護細菌免受宿主免疫系統的影響。表皮葡萄球菌產生的細胞外粘液既可保護細胞免受巨噬細胞的吞噬，也可免受多形核白細胞中的活性氧的影響。同樣，嗜中性白細胞對產生粘液的金黃色葡萄球菌菌株的殺菌活性也會降低。

3 生物膜對抗菌藥物的耐藥性

與同一菌株的浮游細菌相比，在生物膜中生長的細菌對抗菌劑的抵抗力提高10到1000倍，其具體機制可能包括：（1）抗菌劑通過生物膜基質的滲透延遲；（2）生物膜生物的生長速度改變；（3）由于生物膜生長方式而導致的生理變化，包括“持久”細胞。另外，胞外多糖基質的產生是區別生物膜的特征之一，它會與化合物反應或者吸附進而限制抗菌劑在生物膜內地運輸，最終破壞抗生素進入細菌細胞的能力。因此，在成熟的生物膜中可以觀察到細菌的緩慢生長，這也說明生物膜中細菌對抗菌劑的敏感性降低。

4 抗生素對生物膜形成的影響

越來越多的證據表明，抗生素不僅對細菌生物膜的有效性不高，而且還可能刺激生物膜的形成。四環素、喹諾司汀-達福普汀和紅霉素等三類抗生素使用時，可促進表皮葡萄球菌中ICA基因的表達，進而刺激生物膜的形成，亞抑制濃度的抗生素也會影響重要細菌毒力因子的表達，例如其他粘附分子或毒素。

5 生物膜與乳腺炎

在急性和慢性感染的乳腺組織中，細菌主要粘附在乳腺腺泡和乳腺導管的上皮細胞上，并侵入間質組織中，這些細菌簇往往在暴露病原體后24h出現，同時乳腺內部發生感染，而且，金黃色葡萄球菌乳腺炎分離株中ica基因的表達率最高。另外，抗菌敏感性的轉變在一定程度上支持了乳腺感染與生物膜形成有關的假說。在牛原代乳腺上皮細胞測定實驗中，非粘附性金黃色葡萄球菌，對新霉素、青霉素、桿菌肽和四環素的敏感性高于粘附葡萄球菌。金黃色葡萄球菌在豆湯或脫脂牛奶中生長形成生物膜的研究表明，抗生素對年輕生物膜（6h）和在牛奶中生長的生物膜的影響大于對較老生物膜（18h）和在肉湯中生長的生物膜的影響，同時也發現慶大霉素和紅霉素是對抗金黃色葡萄球菌生物膜最不有效的抗生素[2]。

在乳腺炎的演變過程中，牛乳房的生理變化以及細菌基因表達的變化主要發生在亞臨床向臨床的過渡期，從而促進了毒力基因的上調以及病原體的“防御性”生物膜生長轉變，進入一個細菌的有害生長和分布階段，最終導致炎癥發生和臨床體征出現。但是，相變過程中刺激生物膜形成的確切機制有待進一步闡明。

6 結語

隨著奶牛場乳腺炎防控力量的加強，乳腺炎的發病率和體細胞數量在一定程度上有所下降，但是乳腺炎仍然是奶牛最重要的疾病之一，研究生物膜的形成和抗藥機制仍是未來解決乳腺炎防控的重要基礎之一。