豬肝細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)

歐陽(yáng)滿 姜偉業(yè) 舒 婷

（江西醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，江西上饒 334000）

肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)用途廣泛，可用于肝臟的生理病理研究、用于各種藥物經(jīng)肝臟代謝轉(zhuǎn)化過(guò)程的研究。組合型生物人工肝在暴發(fā)性肝功能衰竭患者治療中的支持作用日益受到重視。組織工程肝臟應(yīng)用于臨床，首先要解決其細(xì)胞來(lái)源的問(wèn)題。Donato等人測(cè)定了人、豬、狗、兔及大鼠等肝細(xì)胞中細(xì)胞色素P450的含量及其代謝能力，結(jié)果顯示豬肝細(xì)胞的代謝功能與人肝細(xì)胞最為接近，優(yōu)于其他哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞[1]。以豬肝細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物型人工肝可使部分患者成功橋接到肝移植[2]。高密度高活性的豬肝細(xì)胞是應(yīng)用該技術(shù)的關(guān)鍵。本文采用“杜長(zhǎng)大”乳豬為實(shí)驗(yàn)材料，原位兩步灌流法進(jìn)行豬肝細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用出生一周以內(nèi)的杜長(zhǎng)大豬作為肝細(xì)胞供體。肝素鈉購(gòu)于北京化學(xué)試劑有限公司，戊巴比妥購(gòu)于北京奇華盛有限公司，William’s E Medium粉劑、地塞米松購(gòu)于sigma公司，膠原酶Ⅳ購(gòu)于invitrogen公司。主要實(shí)驗(yàn)器材：二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo），水平離心機(jī)（T.D.L-40.C；上海安亭科學(xué)儀器）廠，倒置顯微鏡（OPTEC）。

1.2 方法

1.2.1 原位兩步灌流法分離豬肝細(xì)胞

（1）手術(shù)前靜注射：選取出生一周以內(nèi)的杜長(zhǎng)大豬，注射肝素鈉抗血凝，股脛注射50mg/kg戊巴比妥麻醉，并用酒精消毒動(dòng)物全身。（2）無(wú)菌條件下打開(kāi)腹腔，輕輕把腸道拉向軀體左側(cè)，暴露腸系膜靜脈，在腸系膜靜脈下穿3條棉線，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，隨后沿肝門(mén)靜脈方向插管，結(jié)扎固定。（3）原位消化前灌流：50ml/min速率灌注37℃預(yù)熱的PBE，灌至肝臟完全變黃，約需2L PBE。（4）摘取肝臟，放入一無(wú)菌平皿中，先用適量PBS清洗，轉(zhuǎn)入預(yù)先盛有20ml 37℃預(yù)熱PBC的平皿中，剪碎組織，37℃消化10～15min，每隔5min搖一下，使消化更加充分。（5）消化結(jié)束后立即加入適量完全培養(yǎng)基，輕柔吹打，過(guò)200目濾布，所得肝細(xì)胞懸液用基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗1～2次，600rpm離心3min，用William’s E Medium完全培養(yǎng)基重懸，臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞活率，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在光鏡下計(jì)算細(xì)胞的產(chǎn)率和活率。

1.2.2 肝細(xì)胞原代培養(yǎng)

（1）計(jì)數(shù)后，用完全培養(yǎng)基William’s E Medium完全培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋成1×106個(gè)/ml的密度。（2）將稀釋后的細(xì)胞懸液接種培養(yǎng)皿，每孔2.5ml。（3）置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4h后觀察細(xì)胞貼壁情況，貼壁后換液，以后每24h換液。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用原位兩步灌流法，平均可獲得8×109個(gè)肝細(xì)胞，細(xì)胞活率93%左右。使用倒置相差顯微鏡對(duì)其生長(zhǎng)過(guò)程進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。可見(jiàn)初分離的肝細(xì)胞大多呈形狀規(guī)則的球形，胞質(zhì)透亮，懸浮于培養(yǎng)基中。接種2h后，肝細(xì)胞大部分開(kāi)始附壁，然后逐漸展開(kāi)，向外伸展，最終呈典型的多角形單層貼壁生長(zhǎng)，可見(jiàn)雙核。接種12h后，肝細(xì)胞均已貼壁。貼壁的肝細(xì)胞其形態(tài)上稍有變化，多角形形態(tài)更加伸展，胞體變平變薄， 體積增大，細(xì)胞間開(kāi)始出現(xiàn)島狀連接。培養(yǎng)14～20 h后，肝細(xì)胞開(kāi)始活躍增生。幾天后，細(xì)胞表面開(kāi)始出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)和空泡，細(xì)胞逐漸死亡并脫落。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用的兩步原位灌流法，細(xì)胞損傷小、分離充分，且排除了紅細(xì)胞的干擾，所獲細(xì)胞多為單個(gè)游離細(xì)胞，所得細(xì)胞產(chǎn)率和活率均較好，滿足了組織工程肝臟作為體外支持系統(tǒng)對(duì)肝細(xì)胞數(shù)目的基本要求。細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中表現(xiàn)為正常肝細(xì)胞的形態(tài)。本實(shí)驗(yàn)建立了穩(wěn)定的豬肝細(xì)胞分離及原代培養(yǎng)體系，獲得了高產(chǎn)率、高活率的豬肝細(xì)胞，為組織工程肝臟在臨床的應(yīng)用提供了穩(wěn)定可靠的細(xì)胞來(lái)源，也為藥物的肝臟代謝轉(zhuǎn)化過(guò)程研究提供了材料。