豬肝細胞的分離與原代培養

歐陽滿 姜偉業 舒 婷

（江西醫學高等專科學校，江西上饒 334000）

肝細胞的體外培養用途廣泛，可用于肝臟的生理病理研究、用于各種藥物經肝臟代謝轉化過程的研究。組合型生物人工肝在暴發性肝功能衰竭患者治療中的支持作用日益受到重視。組織工程肝臟應用于臨床，首先要解決其細胞來源的問題。Donato等人測定了人、豬、狗、兔及大鼠等肝細胞中細胞色素P450的含量及其代謝能力，結果顯示豬肝細胞的代謝功能與人肝細胞最為接近，優于其他哺乳動物肝細胞[1]。以豬肝細胞為基礎的生物型人工肝可使部分患者成功橋接到肝移植[2]。高密度高活性的豬肝細胞是應用該技術的關鍵。本文采用“杜長大”乳豬為實驗材料，原位兩步灌流法進行豬肝細胞的分離與原代培養。

1 材料與方法

1.1 材料

選用出生一周以內的杜長大豬作為肝細胞供體。肝素鈉購于北京化學試劑有限公司，戊巴比妥購于北京奇華盛有限公司，William’s E Medium粉劑、地塞米松購于sigma公司，膠原酶Ⅳ購于invitrogen公司。主要實驗器材：二氧化碳培養箱（Thermo），水平離心機（T.D.L-40.C；上海安亭科學儀器）廠，倒置顯微鏡（OPTEC）。

1.2 方法

1.2.1 原位兩步灌流法分離豬肝細胞

（1）手術前靜注射：選取出生一周以內的杜長大豬，注射肝素鈉抗血凝，股脛注射50mg/kg戊巴比妥麻醉，并用酒精消毒動物全身。（2）無菌條件下打開腹腔，輕輕把腸道拉向軀體左側，暴露腸系膜靜脈，在腸系膜靜脈下穿3條棉線，結扎遠心端，隨后沿肝門靜脈方向插管，結扎固定。（3）原位消化前灌流：50ml/min速率灌注37℃預熱的PBE，灌至肝臟完全變黃，約需2L PBE。（4）摘取肝臟，放入一無菌平皿中，先用適量PBS清洗，轉入預先盛有20ml 37℃預熱PBC的平皿中，剪碎組織，37℃消化10～15min，每隔5min搖一下，使消化更加充分。（5）消化結束后立即加入適量完全培養基，輕柔吹打，過200目濾布，所得肝細胞懸液用基礎培養基清洗1～2次，600rpm離心3min，用William’s E Medium完全培養基重懸，臺盼藍拒染法檢測細胞活率，血細胞計數板在光鏡下計算細胞的產率和活率。

1.2.2 肝細胞原代培養

（1）計數后，用完全培養基William’s E Medium完全培養基將細胞懸液稀釋成1×106個/ml的密度。（2）將稀釋后的細胞懸液接種培養皿，每孔2.5ml。（3）置于37℃，5%CO2培養箱中培養，4h后觀察細胞貼壁情況，貼壁后換液，以后每24h換液。

2 結果

本實驗采用原位兩步灌流法，平均可獲得8×109個肝細胞，細胞活率93%左右。使用倒置相差顯微鏡對其生長過程進行動態觀察。可見初分離的肝細胞大多呈形狀規則的球形，胞質透亮，懸浮于培養基中。接種2h后，肝細胞大部分開始附壁，然后逐漸展開，向外伸展，最終呈典型的多角形單層貼壁生長，可見雙核。接種12h后，肝細胞均已貼壁。貼壁的肝細胞其形態上稍有變化，多角形形態更加伸展，胞體變平變薄， 體積增大，細胞間開始出現島狀連接。培養14～20 h后，肝細胞開始活躍增生。幾天后，細胞表面開始出現顆粒狀物質和空泡，細胞逐漸死亡并脫落。

3 討論

本實驗采用的兩步原位灌流法，細胞損傷小、分離充分，且排除了紅細胞的干擾，所獲細胞多為單個游離細胞，所得細胞產率和活率均較好，滿足了組織工程肝臟作為體外支持系統對肝細胞數目的基本要求。細胞在培養過程中表現為正常肝細胞的形態。本實驗建立了穩定的豬肝細胞分離及原代培養體系，獲得了高產率、高活率的豬肝細胞，為組織工程肝臟在臨床的應用提供了穩定可靠的細胞來源，也為藥物的肝臟代謝轉化過程研究提供了材料。