應重視骨性關節炎微環境中軟骨損傷的修復

孟慶奇 李斯明

廣州市紅十字會醫院，暨南大學醫學院附屬廣州紅十字會醫院骨科（廣州 510220）

骨性關節炎（osteoarthritis，OA）是一種可發生在任何關節軟骨及其周圍組織的疾病，最常見發病部位是膝、髖、手腕等小關節。以最常見的膝關節OA為例，TANG等［1］報告了有癥狀的膝關節OA患病率為8%（定義為自我報告的膝關節疼痛并被醫生診斷為OA），膝關節OA在女性中比男性更常見，隨著年齡的增長而增加，直到70歲左右達到穩定水平。據TIE等［2］報道，中國農村的膝OA總患病率為23.6%，男性占15.4%，女性占28.1%；中國城市總患病率為20.0%～23.9%，男性為13.7%，女性為24.3%，中國農村和城市的患病率無差異。隨著人口老齡化的進程，OA的發病率及所帶來的醫療成本無疑會進一步增加，尋找OA防治的有效措施更加的必要與迫切。本文就OA的發病機制及OA軟骨修復中涉及的微環境變化作一概述。

1 OA的發病機制

OA的發病機制尚不明確，傳統觀點是：年齡、運動、肥胖等相關因素造成的關節退行性變，即關節內的壓力和磨損導致了關節軟骨的損傷，而軟骨細胞再生能力非常差，這是OA及其他類型關節炎證治療的難點所在。上世紀90年代以前一直認為關節軟骨本身因為沒有血管和神經，所以關節軟骨不能像其他組織一樣產生炎癥。直到近年來包括前列腺素在內的諸多因素被證實可以誘導軟骨產生基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPS）（MMPS是關節炎早期病變的基礎），OA也逐漸被認為是一種炎癥誘導發生的疾病。1992年MARTEL-PELLETIER發現人OA軟骨細胞對IL-1和MMPs刺激的敏感性高于正常細胞，而這可能與OA細胞中表達的IL-1R水平升高有關［3］，這也進一步證實了軟骨細胞自身可產生炎癥反應。還有研究者證實軟骨下骨的炎癥反應也參與了骨關節炎的發生和發展過程［4］。現在可以明確的是OA發病過程與關節軟骨、滑膜和軟骨下骨的炎癥信號調控相關，而關節軟骨持續的炎癥反應是造成關節軟骨損傷的主要原因［5］。

2 軟骨生長微環境中的生長和分化因子

現階段對于骨軟骨損傷修復的研究主要集中在：支架材料的構建、種子細胞培育及篩選、軟骨生長微環境的調控三個方面。生長和分化因子是組織工程應用中的重要部分，一些生長和分化因子已被確定參與調節關節軟骨的發育和成熟。生長因子是刺激成分，有助于軟骨發育和軟骨細胞表型的維持，通常用于誘導、加速或增強軟骨組織的形成。轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）家族信號在MSCs的分化中起關鍵作用［6］，但TGF-β在小鼠或兔動物體內過度表達，已經顯示出許多不良反應，如導致局部骨贅形成、腫脹、滑膜增生，纖維化和吸引炎性細胞聚集到滑膜內層的等［7］。這些結果說明需要協調TGF-β的使用來控制軟骨形成。研究最成熟的應該是骨形態發生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs），BMPS是一個比較大的亞族，目前已經發現20多種BMP被提取克隆出來，他們在軟骨形成和成骨過程中發揮著重要作用。BMPs中，BMP-2、-4、-6、-7、-13、-14等具有增強軟骨細胞合成Ⅱ型膠原和聚蛋白多聚糖的作用，促進骨髓間充質干細胞的成軟骨分化的功能，目前仍沒有在人體中進行臨床研究，驗證其增強軟骨修復的潛力，其局限性在于BMPs植入異位區時，會導致軟骨內骨化的發生，這是在軟骨組織工程中需要避免的［8］。成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）家族由22種結構相關蛋白組成，他們分別與4種酪氨酸激酶FGF受體（FGFR）中的其中一種結合，在成體細胞中，FGF對軟骨的作用已經引起較多的關注，在軟骨細胞周圍的基質中天然存在豐富的FGF-2（也被稱為basic FGF，bFGF）），在三維培養中添加FGF-2，能明顯促進聚蛋白多聚糖的合成和骨髓源性間充質干細胞的增殖，有研究發現與高劑量的FGF-2相比，低劑量的FGF-2更能改善兔骨軟骨損傷的愈合，這個結果表明，FGFs的劑量可能與產生的效應是相反的［9］。前期我們研究了體外單層兔軟骨細胞培養的實驗，觀察添加堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）與透明質酸（HA）對兔軟骨細胞的增殖影響，結果發現bFGF在10 ng/mL即可顯著促進軟骨細胞增殖，當bFGF濃度增至50 ng/mL，其促進作用達到最大值；單純使用HA并不促進軟骨細胞增殖；當聯合應用bFGF與HA時，在適宜濃度下可出現協同增強作用。說明bFGF明顯促進軟骨細胞增殖，HA可以維持軟骨細胞的正常生長而不影響細胞的增殖，與bFGF聯合應用時，更利于細胞生長［10］。此外，有研究顯示，FGF-2和-18預處理的間充質干細胞能夠產生促進修復軟骨組織缺陷的間充質干細胞譜系［11］。這說明理解并加以利用FGFs信號通路對軟骨組織工程的發展有著重要作用。胰島素生長因子（insulin growth factor，IGF）家族主要由兩種配體（IGF-1和IGF-2）、兩種細胞表面受體（IGF1R和IGF2R）、六種不同的IGF結合蛋白（IGFBP-1至IGFBP-6）和多個IGFBP蛋白酶組成，這有助于調節多個組織中的IGF活性。在人類和小鼠中，IGF-1和IGF-2的突變會導致發育缺陷和智力遲鈍［12］。這提示IGF對細胞增長和發展的重要性。IGF-1具有促進軟骨細胞存活和增殖，誘導軟骨分化，促進聚蛋白多聚糖合成等功能是軟骨穩態和代謝的重要中介［13］。不同劑量的IGF-1在修復全層關節缺損期間誘導軟骨或軟骨下骨有不同的反應：高劑量的IGF-1對新軟骨的形成和整合更有利，而低劑量的IGF-1對軟骨下骨形成更有效［14］。

3 軟骨損傷與氧化應激

在促使OA的發病的諸多誘因中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）占有重要的位置，ROS可調節細胞內信號傳導過程，誘導軟骨細胞衰老、細胞凋亡、細胞外基質合成和降解失衡、滑膜炎癥和軟骨下骨的功能障礙［15］。過氧化氫酶（Catalase）是幾乎所有暴露于氧氣的生物體（如細菌，植物和動物）中最常見的酶，它能催化過氧化氫分解為水和氧氣，所以Catalase是保護細胞免受ROS氧化損傷的非常重要的酶［16］。氧化損傷涉及許多疾病狀態，包括炎癥性疾病，缺血和再灌注疾病，神經退行性疾病和癌癥，以及細胞信號傳導和免疫［15］。在促使OA發病的諸多誘因中，ROS起到重要的作用，它能影響細胞內信號傳導過程，促使軟骨細胞衰老、凋亡、細胞外基質合成和降解失衡、滑膜炎癥和軟骨下骨的功能障礙［15］。探討復雜的氧化應激信號傳導途徑是探索治療OA的潛在方法的一個選項。

Catalase對IL-1β的作用引人注目，IL-1β在OA發病中有重要作用，IL-1β與IL-1受體1（IL-1R1）結合后能夠增加細胞內Ca2+濃度，激活PKC、p38、ERK1/2、JNK、核因子-κB（NF-κB）、轉錄因子（ATF）和激活蛋白1（AP1）等炎癥信號［17］。IL-1β的天然拮抗劑IL-1受體拮抗劑（IL-1Ra）和2型IL-1誘餌受體（IL-1RII），可以結合IL-1β并阻斷其信號傳導，現已作為治療OA的藥物進行臨床前試驗。IL-1β由前體pro-IL-1β而來，后者須經細胞內酶Caspase-1切割，缺乏Caspase-1的動物沒有成熟的IL-Iβ。Pro-Caspase-1是NLRP3炎癥小體的一部分，NLRP3炎癥小體是一種多蛋白復合物，復合物形成后Pro-Caspase-1即被切割為成熟的Caspase-1，即炎癥小體激活。Caspase-1激活后可促進IL-1β的活化表達［18］。在很多的動物模型中已經證實：Caspase-1和Pro-IL-1β的激活是ROS依賴性的。據報道，幾種NLRP3活化劑如ATP，二氧化硅和石棉引發ROS產生，并且使用ROS清除劑抑制其阻止NLRP3活化。在NLRP3參與痛風性關節炎的發病過程已經明確［19］，但其是否參與OA的發病尚未可知［20］。2012年BOUGAULT等［21］發現在人類與小鼠壓力誘導的OA發病過程中，并不依賴NLRP3的激活途徑。但2018年MCALLISTER等［20］認為NLRP3是一個潛在的OA疾病生化指標，參與了OA的發病過程。

4 基因治療技術在軟骨損傷中的應用

許多生物制劑的半衰期較短，難以在維持有效濃度的情況下長期作用于軟骨缺損部位，從而限制了其體內療效。將目的基因轉移的基因治療技術已經成為臨床治療的一個重要手段，它將目的基因產物在損傷或缺陷部位的細胞中表達，利用這些基因轉移技術，細胞在局部合成目的蛋白質并釋放到周圍微環境中［22］。在軟骨修復中，滑膜細胞、軟骨細胞和間充質干細胞是靶向基因修飾的三種主要細胞選擇類型。最近有報道基因療法在鐮狀細胞病［23］、血友病［24］中都取得了肯定的療效，也許我們可以通過基因轉導賦予有利軟骨細胞功能的基因，例如調節炎癥和賦予細胞長壽，或持續表達透明軟骨表型、生產Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖等。如VERMEIJ等［25］在類風濕關節炎小鼠模型中表達了炎癥依賴性啟動子控制下的抗炎白細胞介素-10（IL-10）基因取得了良好的療效。GRIFFIN等［26］使用IGF-I基因增強的軟骨細胞修復關節軟骨的機械特性和結構得到了理想的效果。再者GONZALEZ-FERNANDEZ等［27］通過基因療法將富含TGF-β3和BMP2髓間充質干細胞聯合藻酸鹽水凝膠用于關節軟骨修復的組織工程也具有良好的可行性。STONE等［28］通過組合Prg4和Il-1ra基因成功預防小鼠創傷后骨關節炎中的痛覺過敏和軟骨退化。基因傳遞的應用最關鍵是需要載體的幫助，載體能有效地將目的cDNA傳遞給目的細胞，并為所需的生物反應提供合適的轉基因表達時間。我們曾利用慢病毒載體針對軟骨細胞的基因進行轉導或修飾。采用由載體質粒pLentiLox3.7、包裝質粒pRSV-REV、pMDLg/pRRE及包膜質粒VSV-G等組成的四質粒包裝系統，四質粒系統可以使各質粒之間的共同重疊序列最小化，盡量減少共轉染細胞后產生有復制能力的病毒的可能，提高了病毒載體的生物安全性，觀察到綠色熒光蛋白基因表達的細胞達到80%以上，說明慢病毒載體能夠高效感染，并實現目的基因的有效表達，有望成為軟骨組織工程中理想的基因運載工具。因此，體外基因傳遞作為讓種子細胞支架復合物過表達和釋放目的蛋白到局部的一種轉移方法，越來越受到關注。

5 展望

深入探討軟骨修復微環境中生長和分化因子，及對ROS的有效調控，將收獲良好的應用前景。基因治療是未來治療OA的方向，不過還存在一些需要解決的問題。如基因轉導后生長因子的濃度可能超過預期，產生生物毒性；轉基因表達的持續時間；臨床相關的動物模型；體外轉基因細胞相對于直接基因轉移方法的優勢以及為每個特定的臨床問題確定最佳的治療因子［29-30］。因此，體外基因傳遞作為一種讓種子細胞支架復合物過表達和釋放目的蛋白到局部的轉移方法，對軟骨修復有很大的前景，但仍處于起步階段。