腹膜透析相關性腹膜纖維化發生機制及治療新進展

林文珊 周添標

汕頭大學醫學院第二附屬醫院腎內科（廣東汕頭 515041）

近年來腎臟替代治療的相關研究受到國內外學者的關注。腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）治療的優勢在于花費低、對殘余腎功能的保護［1］、對血流動力學影響小等［2］。但隨著PD治療的進行，患者腹膜出現腹膜間皮細胞（peritoneal mesothelial cells，PMCs）缺失、上皮細胞-間充質轉分化（epithelial mesenchymal transdifferentiation，EMT）等表現，引起腹膜超濾功能進行性喪失，導致患者終止PD治療。

1 腹膜纖維化的診斷標準

腹膜纖維化（peritoneal fibrosis，PF）與硬化之間無明顯界限［3］，ZHOU等［4］提出了從生化標志物、組織病理及腹膜功能三方面來確立PF診斷。他建議使用參與PF過程的CA125、IL?6等生化標志物用作PF早期診斷及預后評估；病理活檢可作為診斷PF的金標準：其病理特點主要為PD治療后腹膜出現間皮層消失、間皮下致密區增厚、血管透明樣變和血管生成。此外，采取縱向腹膜功能研究可幫助診斷PF，包括追蹤測定腹膜超濾量是否喪失、葡萄糖等小溶質轉運能力是否增加等。

2 PF發生發展機制

2.1 致PF的因素及相關機制

2.1.1 非生理性腹透液傳統腹透液中高級糖基化終產物（advanced glycosylation end products，AGEs）、葡萄糖降解產物（glucose degradation products，GDPs）、高濃度葡萄糖、低PH值和高滲透壓等非生理性因素長期作用于腹膜，抑制了PMCs增殖活性和引起間皮-間充質轉分化（mesothelial mesenchymal transdifferentiation，MMT）［5］。一項病例對照研究發現相同糖負荷下，與使用生物不相容腹透液相比，應用低非生物相容透析液后PF程度輕于前者［6］。高糖本身可直接誘導促纖維化因子表達增多［7］和抗纖維化因子表達減少［8］，另外，透析液的熱殺菌作用和活性氧的刺激也可使葡萄糖代謝產生GDPs和AGEs，后者可激活AGE受體，引起血管細胞粘附分子-1、轉化生長因子-β1（trans?forming growth factor?β1，TGF?β1）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等過表達，導致炎細胞聚集以及腹膜新血管生成等一系列促PF反應［9］。

2.1.2 氧化應激常規腹透液可產生ROS，可導致腹膜高轉運、腹膜增厚、血管生成等情況［10］。作為機體維護自身平衡和自我保護的機制，細胞自噬可降低機體ROS和炎癥因子水平，當機體平衡失調時可引起高活性物質蓄積、脂質過氧化和DNA損傷，導致間皮細胞凋亡、炎癥分子增加，促進纖維化的發生［11-12］。

2.1.3 低氧由于腹膜長期經受著腹透液的非生理刺激，腹膜組織處于缺氧環境中，低氧誘導因子α1（hypoxia in?ducible factorα1，HIF?α1）的表達增多。楊軍等［13］發現在PD患者中，HIF?α1表達與PD齡長短、TGF?β1及VEGF水平正相關，這說明細胞缺氧是介導PF進展和腹膜超濾衰竭機制之一。

2.1.4 腎素-血管緊張素-醛固酮系統（renin?angiotensin?aldosterone system，RAAS）醛固酮不僅可通過介導ERK激活從而誘導活性氧產生，還能通過p38 MAPK通路誘導PMCs發生EMT［14］。前腎素結合其受體后通過MAPK途徑介導TGF?β1的表達［15］，后者被PMCs識別后，進而又促進細胞內酸性細胞器運輸、分泌纖維連接蛋白和可溶性前腎素受體，即TGF?β1正反饋促進前腎素與受體結合，導致TGF?β1過表達，誘導纖維化的發生［16］。

2.1.5 腹膜炎癥細菌、真菌等生物感染所致的腹膜炎及非生理性腹透液和尿毒癥本身的毒性作用引起的長期微炎癥狀態，皆是腹膜纖維化的重要促成因素。LI等［17］用巨噬細胞清除劑將實驗小鼠體內的巨噬細胞清除后再使用腹透液，發現該組腹膜形態學能保持相對穩定，α?SMA表達明顯降低，E?cadherin表達明顯增加，而注入M1和M2巨噬細胞后再使用腹透液發現，與M2巨噬細胞組和無巨噬細胞對照組相比，M1組表現組織損傷和ECM沉積最嚴重，腹膜超濾功能下降最明顯，這說明M1型巨噬細胞在促纖維化方面更為重要。KITTERER等［18］用實時定量熒光PCR分別測定了非尿毒癥患者、未進行腹膜透析的尿毒癥患者（pPD）以及已進行腹膜透析的尿毒癥患者的NFAT5 mRNA、CCL2 mRNA，并用免疫熒光法測定檢測NFAT 5、CCL2、NF?κB p50、NF?κB p65和CD 68的蛋白表達，發現尿毒癥患者NFAT5 mRNA水平較非尿毒癥對照組升高，而進行PD治療與否并未對結果產生影響。該研究結果提示與健康對照者相比，pPD具有誘導NFAT5表達增加的趨勢，并可能通過NF?κB上調PD患者腹膜CCL2的表達，促進CD68+單核-巨噬細胞的遷移和浸潤。

2.2 細胞水平的改變及相關機制

2.2.1 EMTEMT是指上皮細胞轉分化為間質細胞，發生細胞外基質堆積的過程。在PF的發生發展中，TGF?β1是EMT的核心誘導因子，具有介導細胞外基質生成和沉積、誘導血管生成、促進炎細胞浸潤等作用［19］。

2.2.2 TGF?β1/Smads依賴通道TGF?β1與TGF?β1 Ⅱ類受體（TβRⅡ）結合使后者發生構象改變而被TβRⅠ識別，三者共同形成的TβRⅡ?TGF?β1?TβRⅠ復合物激活下游分子Smad蛋白［20］——磷酸化的受體激活型（R?Smads）與共同通路型（Co?Smads）結合，促進胞內信號轉導過程；而抑制型（I?Smads）則競爭性抑制R?Smads與TβRⅠ結合，負性作用于TGF?β1/Smads通路的信號轉導過程［21］。有研究發現實驗敲除Smad3基因的小鼠僅有少量細胞外基質沉積且未見Smad2/3表達，而敲除Smad2基因的小鼠表現出比對照組更明顯的腹膜厚度增加、大量細胞外基質沉積以及TGF?β1的高表達［22］。該實驗證明了Smad3在促進PF發生發展中發揮關鍵作用，同時也證明了Smad2與Smad3在促PF機制中作用完全不同。在趙華等［21］的實驗研究中，不僅TGF?β1、p?Smad2/3在應用葡萄糖氯己定構建的大鼠PF模型中表達水平升高，Smad7的表達也增多；給予褪黑素治療后大鼠PF的程度減輕，此時測得Smad7表達水平下降，考慮Smad7與TGF?β1/Smad通路或存在反饋機制。

2.2.3 TGF?β1/Smads非依賴通道MAPK通道為Smad非依賴通道的重要內容，包括磷脂酰肌醇-3激酶（PI3k）、細胞外信號調節激酶（ERKs）和Akt等多種信號轉導途徑［23］。分別在不同時間點往TGF?β1處理后的大鼠晶狀體上皮中加入等量體外神經生長因子抑制劑UO126，ERK 1/2激活所引起的EMT雖被有效阻斷，但阻斷ERK 1/2信號僅能在TGF?β1誘導EMT的起始階段中起作用，而不能逆轉EMT的發展［24］。彭翔等［25］在體外構建TGF?β1誘導小鼠 PMCs轉分化模型時發現Akt磷酸化水平增加，且與TGF?β1劑量相關；而在使用PI3K/Akt抑制劑后，TGF?β1引起的EMT相關蛋白和基因的改變得到明顯逆轉，這證明了PI3K/Akt信號參與EMT的發生。

ZHU等［26］發現Notch信號的成分Jagged?1、Notch?1以及Notch的下游靶點HES?1 mRNA水平在大鼠TGF?β1誘導的PF模型中均明顯升高，提示Notch途徑可能是TGF?β1的下游通路。

有研究發現HSP47可促進膠原蛋白、α?SMA的表達和巨噬細胞浸潤，參與促進高糖誘導的PF發展［27］。YANG等［28］用AGEs建立小鼠EMT模型，對比分析了轉染HSP 70?cDNA基因和用siRNA沉默HSP 70基因表達后的EMT改變情況，發現HSP 70過表達不僅可抑制TGF?β/smads通路還可抑制細胞外高活性物質產生和p?ERK的表達，改善AGEs誘導的EMT程度，而HSP70的低表達則促進了EMT的發展。實驗發現TGF?β1也可通過TLR?4依賴通道介導淋巴管生成，發揮致PF的作用［29-30］。

2.2.4 腹膜間質細胞缺失腹膜組織病理顯示，非生理相容性透析液引起的PF伴有PMCs脫落、缺失［11］。曹東維等［31］進行的體外實驗通過比較PMCs傳代數量、檢測細胞增殖和細胞周期情況以及測量端粒長度等細胞衰老相關特征性改變，發現透析液可誘導PMCs發生早衰。KSIAZEK等［32］發現PMCs早衰時線粒體膜電位降低和活性氧增加，DNA雙鏈斷裂標志物γ?H2AX焦點過表達，端粒長度未發生改變而端粒酶活性降低，說明氧化應激使PMCs基因組非端粒區域的DNA雙鏈斷裂損傷加速細胞衰老發生。此外，氧化應激還可造成線粒體損傷、凋亡因子釋放，引起細胞凋亡［33］。SHIN等［34］發現內質網應激對腹膜間質細胞具有雙重反應：阻斷抑或提前誘導內質網應激發生均能改善TGF?β1誘導的細胞凋亡情況。這說明內質網應激實為細胞的一種適應性反應，而當應激強度超出細胞能承受的適應時，EMT發生和PMCs凋亡將不可避免。

2.3 基因調控

表觀遺傳是研究不涉及堿基對序列改變而具有穩定傳遞特性的遺傳信息變化的一門學科。最近的研究表明，纖維化過程也受表觀遺傳機制的調節，如肝臟纖維化疾病與DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA（non?coding RNA，ncRNA）等的表達水平關系密切［35］。

2.3.1 微小RNA（microRNA，miRNA）miRNAs為ncRNA中的一類，可在轉錄后水平對mRNA進行調控，從而影響細胞形態和功能。近年來許多研究均證實了miRNAs參與了PD相關性腹膜纖維化，可分為促纖維化miRNAs如miR?NA?15b、miRNA?21等，以及抗纖維化 miRNAs如 miR?NA200c、miRNA29b、miRNA?30a等［36，38］。MA 等［37］分別檢測腹透患者透析流出液中、miRNA?21抑制劑轉染PMCs和小鼠PF模型中腹膜的miRNA?21以及纖維化相關指標的表達，發現miRNA?21促進PF的進展。CHE等［39］證明了mRNA轉錄啟動子區域的Carg盒可為血清應答因子（SRF）作用靶點，后者的激活能促進PMCs中含Carg盒的miRNA?199 a/214基因簇的轉錄，下調E?cadherin和Claudin?2的表達，促進PMCs發生EMT。

2.3.2 長鏈非編碼RNA（long non?coding RNA，lncRNA）LIU等［40］測定了正常腹膜與PDF誘導PF的小鼠模型腹膜232個lncRNA、154個mRNA以及15個miRNA的表達。與正常腹膜相比，纖維化腹膜各類lncRNAs、mRNAs、miRNAs均有高表達或低表達的情況；信號通路分析提示PF與JAK?STAT、MAPK等信號通路有密切關系；基因共表達網絡分析揭示了lncRNA、mRNA、miRNA的多種關系，如lncRNA與mRNA相關、mRNA與miRNA相關。此外還發現了lncRNAs和miRNAs可以共同調節一個mRNA。該研究不僅綜合分析了小鼠PF模型和正常對照組的lncRNA、mRNA和miRNA的差異性表達，還探索了表觀遺傳參與PF的相關信號通路，以及lncRNA、mRNA和miRNA三者作用關系，但對這些基因差異表達的研究仍需進一步深入并加以詮釋其具體機制。

2.3.3 DNA甲基化/去甲基化KIM等［41］發現DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）誘導的RASAL1高甲基化降低了大鼠RASAL 1蛋白的表達水平，腹膜TGF?β1表達升高，腹膜間皮基質層厚度明顯增加；而給予DNMT抑制劑5?氮雜胞苷干預則可改善PF程度。研究發現，一些miRNAs可抑制DNMT的轉錄，如miRNA?29是DNMT?3a和DNMT?3b的直接調節劑等，導致蛋白質編碼基因的去甲基化和轉錄激活，從而促進了基因的表達，另一方面DNMTs在調控某些miRNA表達方面也起著關鍵作用［42］。

2.3.4 組蛋白乙酰化/去乙酰化YANG等［43］進行體外實驗發現高糖誘導EMT時，PMCs組蛋白H3組分發生乙酰化反應，而組蛋白乙酰化酶（histone acetyltransaferase，HAT）抑制劑C646能通過阻斷TGF?β1/Smad3信號通路逆轉EMT。組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）可分為4類，其中傳統觀點認為，Ⅰ類（HDAC1/2/3/8）和Ⅱ類（HDAC4/5/6/7/9/10）與腫瘤的進展和預后有關，最近研究發現Ⅰ類和Ⅱ類HDAC也與PF相關。IO等［44］在大鼠PF模型中發現Ⅰ類HDAC拮抗劑SAHA可抑制Smad通道和相關促纖維化因子如CTGF mRNA的表達，上調組蛋白乙酰化水平及抗纖維化因子如BMP?7 mRNA的表達，并發揮抗炎和抗血管生成作用，從而發揮抗PF作用。而XU等［45］在小鼠PF模型中應用HDAC6的特異性拮抗劑tubastatin A或HDAC6 siRNA也可減少STAT 3和NF?κB p65的磷酸化水平升高、表皮生長因子受體的過表達等促纖維化活動，改善巨噬細胞向損傷腹膜的浸潤，減輕PF反應。

2.3.5 組蛋白甲基化/去甲基化MAEDA等［46］使用組蛋白H3賴氨酸9（H3K9）甲基轉移酶G9a的抑制劑可減低流出液中TGF?β1的水平和流出液中PMCs數量，改善膠原蓄積及單核細胞浸潤情況。這說明H3K9甲基化為PF的機制之一。

3 PF治療進展

3.1 大體水平

3.1.1 改變傳統腹透液成分CUENCA等［47］在尿毒癥小鼠模型中使用低GDP的碳酸氫鈉/乳酸緩沖透析液，觀察到CD4+、IL?17+細胞數量較少，PF和血管生成被抑制，這表明中性PH值、低糖降解產物的腹透液更有利于腹膜完整性的保存。在一項隨機對照試驗［48］中發現艾考糊精進行PD治療時能有效改善腹膜超濾功能損傷，減輕液體超負荷，但同時也有發生無菌性炎癥的可能。氨基酸型腹透液能更好地維持PMCs的生理功能，但同時也可能會導致代謝紊亂［49］，如含有L?精氨酸的氨基酸透析液可誘導間皮生成NO從而引起相關血管效應等［50］。

氨基胍能消除GDPs、減少AGEs生成，并抑制一氧化氮的促血管生成作用，其在PF治療作用在大鼠模型中得到證明［51］。吡哆胺也被證明能減少大鼠模型AGEs蓄積，改善腹膜功能和結構［52］。

KIHM等［53］在尿毒癥大鼠PD模型中，應用苯磷硫胺處理后，大鼠腎臟和腹膜AGE及RAGE的表達降低，腎小球和腎小管間質損傷減少，腹膜運輸特性有明顯的改善，這提示苯磷硫胺具有保護PD和尿毒癥大鼠殘腎和腹膜功能的作用。

3.1.2 抗炎及免疫調節故調節免疫手段的應用在PF治療上也備受關注。塞來昔布在腹膜超濾衰竭大鼠模型中的應用能明顯降低前列腺素E2水平、抑制血管和淋巴管生成、改善腹膜間皮形態學和腹膜超濾功能異常［54］。PMCs受腹透液影響可產生損傷相關模式分子，后者被TLR識別并介導無菌炎癥。RABY等［55］發現采用TLR抑制劑可溶性TLR 2或敲除TLR 2/4基因等措施均可抑制促炎因子和促纖維化因子的釋放，這表明TLR?DAMPs或為治療PF的潛在靶點。嗎替麥考酚酯可緩解腹膜炎癥狀態、減少新血管生成，還可抑制基質合成，促進基質降解，防止細胞外基質收縮硬化，發揮抗纖維化作用［56］。

3.1.3 其他針對致纖維化大體水平上的治療據報道，低分子肝素或可通過抑制HIF?1α、VEGF、TGF?β1從而改善腹膜功能［57］。WAKABAYASHI等［58］發現予大鼠口服抗氧化劑蝦青素能抑制PF的發展，甚至可預防腹膜損傷，其機制是蝦青素通過抑制炎癥和氧化過程從而發揮抗血管生成及降低腹膜TGF?β1、Snail mRNA和α?SMA的表達的作用。應用ACEI/ARB可降低促纖維因子TGF?β1和PAI?1等的表達［59］，減少腹膜膠原纖維沉積［14］，故ACEI/ARB可作為預防PF發生的治療。

3.2 細胞水平

3.2.1 抑制EMT過程LI等［60］發現抑制核心巖藻糖基化（一種TβR翻譯后修飾）可通過阻斷TGF?β1和PDGF信號通路減輕大鼠PF程度，因此阻斷核心巖藻糖基化可能是治療PF藥物開發的潛在靶點。WANG等［61］分別在大鼠腹膜出現損傷時與發生纖維化時給予吉非替尼，結果提示吉非替尼不僅可預防PF的發生，還能中止纖維化進展。多種生長因子抑制劑蘇拉明可通過抑制TGF?β1信號傳導、炎癥浸潤和血管生成，有效地減輕腹膜纖維化的發展［62］。LEE等［63］在動物模型中發現VitD可抑制α?SMA過表達和E?cadherin低表達，并降低減輕氯己定誘導的腹膜形態和功能異常。因此，藥物使用所帶來的副作用及不良反應不容忽視。

3.2.2 保護PMCs夏陽陽等［33］發現使用丹參酮ⅡA能有效抑制細胞氧化應激作用，并下調PMCs凋亡因子表達，從而表現出對腹膜的保護作用。研究發現硒可降低腹膜間皮細胞中ROS的生成，抑制ROS/MMP?9信號通路激活和PI3K/Akt信號級聯反應，減輕EMT程度［64］。高糖透析液可通過持續性誘導腹膜細胞發生依賴Beclin?1自噬而引起凋亡和纖維化，而使用siRNA抑制Beclin?1自噬后TGF?β1表達減少［65］。

3.2.3 細胞療法將來源于PD患者腹透液中的上皮細胞樣（Epi）細胞和成纖維細胞樣（Fib）細胞分別移植到小鼠PF模型受損的壁層和臟層腹膜上，發現移植Epi細胞組的腹膜未見無明顯粘連，壁腹膜和臟腹膜無增厚，促纖維化因子表達降低；而移植Fib細胞組則相反［66］。這提示間皮細胞移植或有潛在治療前景，但仍需進行更完善的實驗設計。此外，來自于骨髓、脂肪組織［67］或人臍帶血［68］的間充質干細胞在移植到腹膜后改善了PF組織學表現［69］。SHEN等［70］從不同透析齡的不同患者PD流出液中均分離出同一種表型造血干細胞，該來源的干細胞的腹腔定植能力比臍血來源者更強。

3.3 基因水平早前已有TGF?β1的致纖維化作用可被腺病毒介導的核心蛋白聚糖基因轉染抑制的相關報道［71］。然而，腺病毒載體在受體中只產生短暫的基因表達，因此需重復多次注入才可獲得持續性或高濃度目的基因表達。然而，腺病毒載體的高免疫原性可引起強烈的炎癥反應，甚至可為致命性，這限制了腺病毒進一步在臨床上的應用［72］。CHAUDHARY等［73］建立酵母多糖誘導的PF大鼠模型研究對比了未予治療及分別用金納米粒和腺病毒介導的核心蛋白聚糖基因治療PF的效果。與未予治療組相比，使用基因治療的兩組大鼠PMCs表型改變明顯減少，TGF?β1、α?SMA等水平明顯降低。

對目的基因轉錄水平和轉錄后水平修飾的調節也可能成為治療PF的潛在治療方法。增加外源性抗纖維化ncRNAs或促進其表達、沉默促纖維化ncRNAs等措施在動物實驗中取得了成效［38，44］，但在臨床中的應用及推廣則需要大量的安全性檢測和進一步的人體試驗。

3.4 其他SOUSA等［74］提出把腹透患者暫停≥1個月PD治療和將腹透臨時轉為血透以給予腹膜休息的方法可保護腹膜功能，發現腹膜休息可逆轉腹膜異常功能狀態，但需在腹膜功能尚且可逆時起作用，這強調了早期應用腹膜休息治療。一項關于包裹性腹膜硬化的多中心研究發現他莫昔芬能延長腹膜硬化患者生存時間［75］。另外，中藥制劑對PF的治療作用也值得期待和探討，如柴胡可通過抑制氧化應激和巨噬細胞浸潤減輕PF程度［76］；黃芪可抑制單核/巨噬細胞的募集和活化，從而降低透析腹膜中TGF?β1的產生，明顯改善腹膜間皮下上皮細胞層的纖維化和腹膜厚度［77］等。

4 展望

PF的發病機制主要包括腹膜炎損傷、尿毒癥的自毒作用以及非生理性腹膜透析。PD相關性PF發生最關鍵的是TGF?β1因子的激活，但具體的分子機制尚未明確。隨著對PF發病機制的探索的進一步深入，防治的手段愈來愈多，如調整腹透液成分、抑制TGF?β1作用、保護間皮細胞、使用基因治療、調節免疫功能、移植干細胞等。然而需要注意的是，臨床上仍未有治療PF的有效藥物。上述措施大多處于實驗研究階段，就算有少部分已應用于臨床，但仍缺乏大樣本數據分析和足夠的循證醫學證據；因此對PD相關性PF的研究還需要不懈深入，繼續尋找有效、安全的防治方法。