淺析血凝抑制試驗操作注意事項

崔 旭 黃春華

（1.重慶市石柱縣下路街道畜牧獸醫站，重慶 409100；2.重慶市石柱縣動物疫病預防控制站，重慶 409100）

血凝素（HA）的病毒能凝集人或動物紅細胞，稱為血凝現象，血凝現象能被相應抗體抑制稱為血凝抑制試驗，一種測定抗原或抗體的技術。即加入特異性抗體或特異性抗原后，使原有的血凝反應被抑制，動物疫病方面主要用于H5亞型與H7亞型禽流感、新城疫等疫病的免疫抗體滴度測定，為免疫程序的制定提供技術支撐。為現行的家禽調運監管政策，H7亞型禽流感監測報告出省有效期為21天提供指導依據。此法簡稱“75μl”法，雖然看似簡單，但在阿氏液、PBS液、1%紅細胞制備、抗原驗證、4倍病毒抗原回歸試驗等方面仍存在許多注意事項，只有做好操作過程中的每個細節，方能最大限度減少誤差，確保結果的準確性。現將試驗過程中注意事項簡單分析以下：

1 實驗前的工作準備注意事項：

（1）房間溫度應恒溫控制在20～25℃，溫度過高或者過低都會影響實驗反應時間，所以整個實驗過程應控制在一個恒定的溫度下完成。

（2）工作臺在實驗進行前和實驗結束后都要徹底消毒，以免造成污染，建議用75%酒精均勻的噴灑工作臺反復三遍。

（3）樣品與試劑均應提前20min從冰箱取出恢復至常溫后，方可進行實驗。

2 材料的準備注意事項

（1）96孔微量反應板的選擇，在選擇反應板的時候一定要仔細觀察是V型還是U型，本實驗應該選著V型反應板，當不便觀察的時候可以用手觸摸孔底有尖尖的刺感來判斷是V型還是U型。

（2）PBS液、阿氏液和1%紅細胞的制備：阿氏液和PBS液配制過程中應注意酸堿度的調整，阿氏液pH值應調整在6.1，PBS液pH值應該在7.2，配置好的阿氏液和PBS 液經高壓滅菌后方可使用，或者4℃保存，但保存時間不宜過長，一般不超過21d。1%紅細胞配制過程中，在選擇公雞時一定要選擇無特定病原（SPF）公雞3～5只。在洗滌紅細胞離心機轉速保持在1500轉左右約3～5min，轉速過快會造成紅細胞破裂造成溶血。洗滌次數保持在4～8次之間，實際操作過程中以離心后的上清液與PBS液保持同等清晰度時為準，備用。

3 實驗過程中注意事項

（1）病毒抗原效價的測定，每次試驗前均應檢測病毒抗原效價，因為病毒抗原效價一經使用會隨著使用次數逐漸降低，在恒溫狀態下應充分保證靜置反應時間在40min后以最后1孔完全凝集狀態讀取結果。

（2）倍病毒抗原液的配制及驗證，此項是本實驗操作的關建，以病毒抗原log2效價除以4作為抗原稀釋倍數，例如抗原效價為log10，則稀釋倍數為256，驗證配制好的4倍抗原液以前2孔完全凝集狀態，第3孔為半凝集狀態（出現點狀紅細胞沉集，淚流狀態不明顯），第4孔紅細胞成紐扣狀沉于孔底，紅細胞完全沉集淚流狀態明顯下流。若回歸試驗未成立，則需重新測定抗原效價、配備4倍抗原再次回歸試驗直至成立，以最佳狀態的稀釋倍數抗原備用。

（3）樣品稀釋，將恢復常溫的樣品加入到凝集板中，加樣時槍頭應懸空，并一次性排出樣品，做明樣品和陰陽性對照標記。倍比稀釋過程中，避免槍頭松動吸入空氣，產生氣泡，移液器每孔吸放次數在10次左右，稀釋至第10孔結束，若操作過程倍比稀釋不好，會產生跳孔現象。

（4）結果判定，在紅細胞加入后靜置40min后方可讀取結果，實際操作過程中可以參照對照紅細胞孔將呈明顯的紐扣狀沉于孔底、對照病毒抗原孔出現完全凝集時，可讀取結果，讀取結果時應將反應板作45°傾斜，背面墊A4紙作為底色，以完全抑制紅細胞凝集的最大稀釋倍數判為該血清的血凝抑制滴度。讀取結果應在10min之內完成，時間過久會導致反應時間過長，誤判效價。