缺血后處理對缺血再灌注大鼠心臟凋亡相關(guān)酶活性的影響*

洪 勇

安徽衛(wèi)生健康職業(yè)學院醫(yī)學技術(shù)教研室 池州 247099

缺血再灌注損傷是指心肌組織血供中斷后采用溶栓等治療措施在恢復缺血區(qū)血供的同時進一步加劇損傷并引起心臟功能障礙的現(xiàn)象。這一現(xiàn)象給缺血性心肌病的治療增加了困難。2003年有學者首次提出缺血后處理這一手段[1]，即再灌注前給予多次短暫再灌注/缺血過程，能明顯減輕復灌造成的心肌組織損傷。本研究采用冠狀動脈結(jié)扎的方法[2]制備大鼠心肌缺血再灌注模型并觀察缺血后處理對心肌細胞凋亡及凋亡相關(guān)酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠體質(zhì)量(220±20)g，購于青龍山動物繁殖場。

1.2 試劑 原位末端標記法(TUNEL)染色試劑盒購自凱基生物科技發(fā)展有限公司；Caspase 3活性檢測試劑盒、Caspase 9活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京南京建成生物工程研究所。

1.3 分組及模型制備 30只大鼠隨機分為模型組、假手術(shù)組、缺血后處理組，每組10只。大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉(30 mg/kg)ip 麻醉后連接小動物呼吸機進行人工呼吸。開胸暴露心臟，結(jié)扎冠狀動脈左前降支40 min，以心電圖顯示 ST段明顯抬高、T波高聳表示模型制備成功。再灌注2 h前給予5個循環(huán)的缺血/再灌注后處理(10s/10s)。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。

1.3.1 HE染色 將各組大鼠心臟石蠟塊切片、常規(guī)脫蠟至水，HE染色，光鏡下觀察心臟病理學變化。

1.3.2 TUNEL染色 心肌組織固定、石蠟包埋、切片后，按試劑盒說明書染色。光鏡下觀察，每張切片隨機選擇6個視野，計數(shù)凋亡陽性及陰性細胞數(shù)，計算凋亡率。

1.3.3 酶活性檢測 酶標儀分別測定心肌組織勻漿Caspase-3 及 Caspase-9活性，具體步驟見試劑盒說明書。心肌勻漿蛋白含量測定采用Bradford法。

1.3.4 T-AOC及MDA水平檢測 酶標儀分別測定心肌勻漿T-AOC及MDA水平，具體步驟見試劑盒說明書。心肌勻漿蛋白含量測定采用Bradford法。

2 結(jié)果

2.1 缺血后處理對大鼠心肌組織病理組織學影響 光鏡下可見，假手術(shù)組大鼠心肌細胞結(jié)構(gòu)完整，染色均勻，胞核居于細胞中央。缺血再灌注大鼠部分可見心肌纖維斷裂，細胞水腫、變性、壞死。缺血后處理組大鼠心肌細胞輪廓完整，胞質(zhì)輕度水腫，心肌細胞變性、壞死較少(圖1)。

A 假手術(shù)組；B 缺血再灌注模型組；C 缺血后處理組。

圖1 大鼠心肌組織HE染色(×400)

2.2 缺血后處理對大鼠心肌細胞凋亡的影響 假手術(shù)組大鼠心肌未見明顯細胞凋亡(圖2)；缺血再灌注組大鼠心肌細胞凋亡顯著增加(P<0.01)，缺血后處理組大鼠心肌細胞凋亡數(shù)明顯減少(P<0.05)(表1)。

A 假手術(shù)組；B 缺血再灌注模型組；C 缺血后處理組。

圖2 大鼠心肌組織TUNEL染色(×400)

組別凋亡率/%假手術(shù)組3.42±0.47模型組33.68±7.76**缺血后處理組24.00±5.33#

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

2.3 缺血后處理對大鼠心肌組織Caspase-3 及 Caspase-9活性的影響 與假手術(shù)組相比，缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡率升高的同時，Caspase-3 及 Caspase-9活性顯著升高(P<0.01)，缺血后處理組大鼠心肌組織上述指標明顯降低(P<0.05)(表2)。

表2 缺血后處理對大鼠心肌組織Caspase-3 及Caspase-9活性的影響

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.4 缺血后處理對大鼠心肌組織TAOC 及 MDA水平的影響 缺血再灌注大鼠心肌總抗氧化能力明顯降低，MDA水平明顯升高(P<0.01)，缺血后處理明顯提高心肌抗氧化能力，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平(P<0.05)(表3)。

表3 缺血后處理對大鼠心肌組織TAOC 及MDA水平的影響

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

缺血再灌注損傷往往繼發(fā)于急性心肌梗死溶栓治療、冠狀動脈成形術(shù)、心臟外科體外循環(huán)等治療過程中。研究表明，再灌注可通過激活氧化應激、Ca2+超載、炎癥等[3-4]途徑誘發(fā)心肌細胞凋亡，從而造成缺血組織進一步損傷。阻斷細胞凋亡的發(fā)生，對維持或改善心功能有積極意義[5]。本實驗通過HE染色和TUNEL染色觀察到：經(jīng)過2 h缺血和40 min復灌后，心肌組織出現(xiàn)部分肌纖維斷裂，細胞水腫、變性，細胞凋亡率明顯升高。而復灌前給予5次短暫再灌注/缺血處理則明顯減輕上述損傷效應。

文獻報道氧化應激介導的線粒體凋亡途徑在心臟缺血再灌注損傷中扮演重要角色[6-7]。Caspase是細胞線粒體凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，其中Caspase 9是 Caspase級聯(lián)反應的起始因子，活化后可以激活線粒體凋亡途徑。Caspase 9通常以酶原形式存在，在凋亡因子等的刺激下，形成二聚體，激活下游的Caspase 3，活化的 Caspase 3能夠抑制抗凋亡蛋白、DNA修復因子等功能的發(fā)揮，誘導細胞凋亡[8-9]。我們檢測了各組大鼠心肌組織Caspase 3、Caspase 9酶活性以及氧化應激指標，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注組大鼠心肌Caspase 3、Caspase 9酶活性相較于假手術(shù)組大鼠顯著升高，這與文獻報道[10]一致。同時總抗氧化能力降低，脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA水平升高。缺血后處理明顯減輕再灌注造成的氧化損傷及凋亡酶激活。由此推測缺血后處理可能通過抑制氧化應激誘導的凋亡相關(guān)蛋白酶活性來減輕缺血再灌注造成的大鼠心肌細胞損傷。