獼猴桃POD基因的克隆和表達分析

陳義挺, 賴瑞聯, 馮新, 高敏霞, 程春振, 陳文光, 吳如健

?

獼猴桃基因的克隆和表達分析

陳義挺1, 賴瑞聯1, 馮新1, 高敏霞1, 程春振2, 陳文光1, 吳如健1*

(1. 福建省農業科學院果樹研究所，福州 350013; 2. 福建農林大學園藝植物生物工程研究所，福州 350002)

為了解獼猴桃基因的表達調控功能，采用RT-PCR技術從‘米良1號’獼猴桃(‘Miliang-1’)克隆了2個POD家族成員基因(和)。結果表明，和開放閱讀框分別為984和957 bp, 預測分別編碼327和318個氨基酸，GenBank登錄號分別為MF774100和MF774101。AdPOD27和AdPOD64為親水性堿性蛋白，屬于植物亞鐵紅素依賴Ⅲ型POD超家族成員，含有信號肽、跨膜螺旋結構和磷酸化位點，亞細胞定位預測分別定位于線粒體和細胞外。qRT-PCR結果表明，在脫落酸(ABA)和4℃處理時表達量急劇上升，而只在ABA處理時表達量顯著提高。此外，表達量與POD活性、表達量均存在顯著相關性。因此，和可能在獼猴桃果實軟化、低溫響應和ABA誘導等過程中發揮重要的調控功能。

獼猴桃；過氧化物酶；果實軟化；低溫；脫落酸

獼猴桃()是獼猴桃科(Actini- diaceae)獼猴桃屬落葉藤本果樹，果實中富含維生素C、亞麻酸、氨基酸和微量元素等，被認為是20世紀野生果樹馴化最成功的果種之一[1]。然而，獼猴桃果實耐貯性差，采后易軟化腐爛，嚴重影響獼猴桃可食性和商品價值，如何延長獼猴桃貯藏保鮮期成為獼猴桃產業發展亟待解決的難題[2]。

過氧化物酶(peroxidase, POD)是由單一肽鏈與卟啉組成的一種血紅素蛋白，能夠以鐵卟啉為輔基，以H2O2為電子受體催化底物氧化，在植物體內發揮抗氧化作用。POD是多基因家族編碼的同工酶，功能廣泛且豐富多樣，在植物生長、發育和衰老過程中，POD活性水平均有強烈變化[3–4]。此外，POD還參與植物激素調控、活性氧代謝、抗病蟲、耐干旱脅迫等生理過程，是植物響應逆境脅迫的關鍵酶之一。過表達過氧化物酶基因明顯提高番茄對苯酚脅迫的耐受性[5]；基因能夠響應缺硼脅迫改變柑桔砧木中木質素含量[6]；POD活性會影響溫州蜜柑貯藏過程中果皮和果肉中的枯水發生，進而影響果實采后衰老[7]。

已有研究表明，POD在獼猴桃采后貯藏和保鮮過程中發揮重要作用。Zolfaghari等[8]認為，低溫下獼猴桃POD活性均提高，長時間冷藏于(1±1)℃, 相對濕度(80±5)%有利于維持獼猴桃最佳品質。獼猴桃花后不同時間采收的果實中POD活性也存在顯著差異[9]。在獼猴桃采后貯藏效果影響因素研究中，一氧化氮、1-甲基環丙烯、氮氣、硫化氫和槲皮素等均能上調獼猴桃果肉中POD活性，維持風味品質和較高的抗病能力，減少果實冷藏冷害，延緩果實衰老，但也可能引起部分品種果心木質化[10–17]; 而草酸能夠顯著抑制獼猴桃果肉中POD等木質素合成相關酶的活性，減輕因木質化引起的果實品質劣變[18]。此外，微波、高壓和熱處理也會影響獼猴桃果汁和果醬中POD活性，從而改變其貯藏效果[19–20]。

低溫貯藏是延長獼猴桃果實貨架期的有效途徑，而脫落酸(abscisic acid, ABA)在獼猴桃后熟衰老過程中能夠促進水解酶活性增強，參與獼猴桃果實成熟過程的軟化啟動[21]。目前，獼猴桃POD相關研究主要集中在POD活性改變對果實貯藏、衰老和品質等生理方面影響，其分子機理尚不明確。低溫和ABA作為目前已知的獼猴桃軟化兩個重要相關因素，其在軟化過程中與POD的相互作用關系及其調控機制也未見報道。而在前期研究中，通過高通量轉錄組測序發現，和在獼猴桃不同貯藏處理組中存在明顯的轉錄水平差異。鑒于此，試驗以‘米良1號’獼猴桃為材料，對獼猴桃基因組中預測的這2個基因家族成員進行驗證和生物信息學分析，同時研究了獼猴桃貯藏軟化、低溫和ABA處理下POD活性和表達模式的相關性，以期為獼猴桃基因的調控功能研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗所用‘米良1號’獼猴桃(‘Miliang-1’)采自福建省農業科學院果樹研究所建寧獼猴桃基地。2017年9月份，采集大小相近，成熟度一致，無病蟲害和機械損傷的果實，參考陳義挺等[22]的方法進行處理，將獼猴桃隨機分為6組(編號1~6)，每組10個果實，組1為25℃不貯藏(對照)，組2為25℃中貯藏1周，組3~5分別為4℃下貯藏1、2和3周，組6為50 mg L–1的ABA浸泡2 min后于25℃中貯藏1周。每處理重復3次，經液氮速凍后保存于-80℃超低溫冰箱中用于POD活性測定和RNA提取。

1.2 POD活性測定

根據獼猴桃基因組數據庫對和序列進行驗證，分別獲得長度為984和957 bp的ORF序列，預測分別編碼327和318個氨基酸，起始密碼子均為ATG，終止密碼子分別為TAA和TAG (圖2, 3)。POD27和POD64與‘紅陽’獼猴桃(‘Hongyang’)基因組相應CDS序列(GenBank登錄號: Achn356831和Achn132211)的相似性分別達到99.39%和99.16%，而和間的核苷酸和預測蛋白序列的相似性分別為49.45%和40.00%。通過NCBI比對，獼猴桃與煙草()和楊樹()的相似性分別為74%和73%，與葡萄()和向日葵()的相似性分別為82%和79%，表明所獲得的序列為獼猴桃相應基因，分別命名為和，GenBank登錄號分別為MF774100和MF774101。

1.3 RNA提取和cDNA逆轉錄

以獼猴桃為內參基因進行qRT-PCR試驗。將各cDNA樣品等體積混樣，隨后按10–1、30–1、90–1和270–1進行梯度稀釋用于繪制標準曲線，根據擴增效率篩選適宜的退火溫度檢測不同樣品中基因的相對表達量。采用Eppendorf Realplex4熒光定量PCR儀設置qRT-PCR擴增程序：94℃預變性30 s; 94℃變性10 s，TM退火15 s，72℃延伸10 s，循環40次；94℃ 15 s，60℃ 15 s，再以0.11 ℃ s–1的速度升溫至94℃保持15 s，繪制融解曲線。qRT-PCR反應體系為2×TransStart?Top Green qPCR SuperMix 10L，Passive Reference Dye (50×) 0.4L，上下游引物(表1)各0.2mol L–1，模板0.5mol L–1。采用Excel 2003和SPSS 19.0進行數據統計、差異顯著性分析和相關性分析。

1.4 基因克隆

與對照相比，25℃和ABA處理的獼猴桃貯藏1周后POD活性顯著提高(<0.01)，此時獼猴桃硬度急劇下降，可溶性固形物含量上升，果實軟化[21]，可見POD參與了獼猴桃軟化過程，并且POD活性可能受ABA影響(圖1)。而低溫貯藏過程中，4℃貯藏1周后POD活性明顯提高，隨后急劇下降，3周后重新上升恢復到對照水平(>0.01)，說明獼猴桃POD活性能夠響應低溫誘導，在獼猴桃抗冷早期發揮重要作用。可見，POD可能在獼猴桃貯藏軟化、ABA誘導和低溫響應過程中發揮調控作用。

作為一家全球性的集團公司，Walter主要研發、生產和銷售用于金屬加工的精密刀具。品牌Walter是可轉位硬質合金和PCD刀具系統生產商；品牌Walter Titex是高速鋼和整體硬質合金鉆頭及鉸刀生產商；品牌Walter Prototyp以高速鋼、整體硬質合金螺紋加工刀具和銑刀而聞名；Walter Valenite提供可轉位車刀片、鉆頭、銑刀和高技術含量的MODCO品牌非標刀具。

表1 基因克隆、qRT-PCR引物序列

1.5 生物信息學分析

采用在線軟件進行POD生物信息學分析, 基本理化性質(ExPASy，http://web.expasy.org/ protparam/),信號肽(SignalP 4.1 Server，http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)，亞細胞定位(PSORT Prediction, https://psort.hgc.jp/form.html), 跨膜結構(TMpred, http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html), 磷酸化位點(NetPhos 3.1 Server, http://www. cbs.dtu.dk/services/NetPhos/), 保守結構域(NCBI conserved domain searc, https://www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，結合位點(PROSITE, http://www.expasy.ch/prosite)，卷曲螺旋結構(COILS, http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html),蛋白質二級結構(PSIPRED, http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/ psipred/), 蛋白質三維結構(SWISS-MODEL, https:// swissmodel.expasy.org/)。

1.6 qRT-PCR分析

采用植物多糖多酚試劑盒RNAprep pure Plant Kit提取獼猴桃總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳和紫外光分光光度計進行質量和濃度檢測合格后進行等量混合，利用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄cDNA用于PCR擴增，同時采用 TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removel; TransGen Biotech, Beijing)逆轉錄cDNA用于qRT-PCR試驗。

由于互聯網發展的歷史原因，以傳輸控制協議（TCP）/網際協議（IP）為核心的互聯網模型將“盡力而為”的可達性作為網絡的首要任務，這使得報文攜帶的目的地址在路由過程中成為了唯一的決定因素。這種僅依靠目的地址的路由方式，大大限制了對報文轉發控制的靈活性。并且隨著互聯網規模的迅速增長和用戶業務的多樣化，傳統路由協議越來越難以滿足許多業務對服務質量的要求。

2 結果和分析

2.1 POD活性

從已公布的獼猴桃基因組數據庫(Kiwifruit Genome Database, http://bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/home.cgi)中搜索并下載獼猴桃和基因可能序列(Gene ID：Achn356831和Achn132211),設計引物(表1)進行ORF全長擴增。PCR擴增體系為：2×?HiFi PCR SuperMix 12.5L，cDNA模板50 ng，上下游引物各0.1mol L–1，補足高壓ddH2O至終體積25L。PCR擴增程序為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，TM退火30 s，72℃延伸1 min，35次循環后再72℃延伸8 min。PCR產物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切割預期目的條帶采用?Quick Gel Extraction Kit回收，根據試劑盒說明書采用?-T5 Zero Cloning Kit連接目的片段和載體，轉化到-T1感受態細胞中涂板，37℃暗下培養12 h后挑取單克隆子進行PCR檢測，選取陽性克隆子送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序。

2.2 POD基因克隆

根據POD催化H2O2氧化特定底物，在470 nm有特征光吸收的原理，采用植物過氧化物酶試劑盒(購自蘇州科銘生物技術有限公司)測定獼猴桃的POD活性。

2.3 POD生物信息學分析

芬頓氧化技術的影響因素主要為pH值、Fe2+、H2O2投加量及投加方式。普通的芬頓氧化技術中雙氧水加藥方式為單點投加，而這種加藥方式在雙氧水投加初期系統會產生大量羥基自由基，過多的羥基自由基不能完全與廢水中有機污染物發生反應，導致芬頓試劑產生的部分羥基自由基被無效消耗，最終導致雙氧水利用率下降以及降低預處理效果。本文主要研究多點投加芬頓氧化技術最佳反應條件和多點投加方式的優化(包括投加位點及投加量)。

2.4 POD表達模式分析

從圖5可見，25℃貯藏1周后獼猴桃的表達量是對照的1.5倍，而的表達量未出現顯著變化，說明可能參與獼猴桃果實軟化過程，而的調控作用較不明顯。ABA處理后，和的表達量急劇上升，分別為對照的419和23倍，說明二者均能夠響應ABA誘導，尤其是。獼猴桃果實在4℃處理1周后，的表達量明顯上調，為對照的98倍，隨后下降，在低溫貯藏后期的調控也不明顯，而的表達量幾乎不發生改變。此外，在所有處理中，的表達量均高于，可見，可能在獼猴桃果實軟化、低溫響應和ABA誘導等過程中比發揮更全面的調控功能。

生物信息學分析表明，AdPOD27和AdPOD64的基本理化性質存在一定差異(表2)，二者均為親水性堿性蛋白，但AdPOD27屬于穩定蛋白，而AdPOD64屬于不穩定蛋白；AdPOD27中亮氨酸(Leu)含量最多，達到9.8%，其次是賴氨酸(Lys)和丙氨酸(Ala)，分別為8.3%和8.0%，而AdPOD64中絲氨酸(Ser)含量最多，達到11.3%，其次是Leu和Ala，均為10.1%。亞細胞定位表明，AdPOD27和AdPOD64可能分別定位于線粒體和細胞外，二者分別于氨基酸序列5?端第1~26位和第1~24位氨基酸含有信號肽。保守結構域和結合位點預測表明, AdPOD27和AdPOD64蛋白均屬于植物亞鐵紅素依賴Ⅲ型過氧化物酶超家族成員，主要參與細胞間隙和液泡的過氧化氫分解、生長素代謝、木質素合成和脅迫響應等(圖2, 3)。TMpred分析表明，AdPOD27含有4個由內向外和由外向內的跨膜螺旋結構以及28個磷酸化位點，AdPOD64含有4個由內向外和2個由外向內的跨膜螺旋結構，磷酸化位點個數為38。二級結構預測表明，AdPOD27中-螺旋和-折疊分別占45.9%和4.6%，而AdPOD64中二者含量分別為47.8%和2.5%。SWISS-MODEL預測表明, AdPOD27和AdPOD64與棕櫚(, PDB: 4usc.1.A)的相似度分別達到45.12%和46.44%，以此為模型預測2個獼猴桃POD的三維結構(圖4)。

2.5 相關性分析

采用SPSS19.0進行Pearson相關性分析, 結果表明，獼猴桃經不同處理，的表達量與POD活性呈顯著正相關(=0.533,=0.023<0.05),而與的表達量呈極顯著正相關(=0.947，=0<0.01)。此外，的表達量與POD活性也存在正相關關系，但不顯著(=0.430,=0.075>0.05)。可見，在獼猴桃果實軟化、低溫響應和ABA誘導過程中,和可能相互影響，而可能通過上調和下調表達影響POD活性，從而起到更重要的調控作用。

“……這樁慘絕人寰的人身傷害案發生在28日深夜10點18分。被害人王大明是我市飛騰集團董事長兼總經理。據王大明說，兇手一共有三人，他在毫無防備的情況下被他們入室襲擊，由于兇手用絲襪套頭，王沒有看到兇手的真面目……多年來，王大明一直致力于飛騰集團的發展壯大，為我市的經濟發展……”

表2 AdPOD27和AdPOD64的基本理化性質

3 討論

大量研究表明，POD在ABA介導的非生物脅迫響應過程中具有重要調控功能。外源噴施ABA能夠提高水稻()幼苗的POD活性，增強其清除自由基的能力從而獲得更高的抗寒能力[23]; 葉片或者根系外施ABA能夠增強POD等抗氧化酶活性，維持植物膜系統和光合器官的穩定性，降低超氧陰離子和過氧化氫含量，延緩膜脂丙二醛含量增加，顯著提高獼猴桃、姜()、小麥()和豌豆()等植物抗干旱能力[24–27]；ABA處理還導致小麥胚胎超氧自由基、過氧化氫和氧化應激指標提高，從而誘導部分POD同工酶活性增強[28]。此外，對番茄()、甘蔗(spp.)和檉柳()等的研究也表明，ABA能夠誘導上調表達[29–31]。本試驗中，ABA處理的和表達量大幅度提高，說明這2個成員參與了ABA介導的非生物脅迫響應過程，然而與25℃處理相比，POD活性整體水平并沒有顯著變化，表明仍有其他POD同工酶參與了該過程，結果也預示著POD同工酶不同成員可能存在特異的調控功能。

低溫貯藏是獼猴桃延緩果實軟化，延長貨架期的有效手段，然而果實低溫貯藏過程中冷害常常導致果面皺縮，果肉水漬化[32]。而果實采后抗冷性與抗氧化性酶活性呈顯著正相關性，通過低溫鍛煉或逐步降溫保存可以顯著增強POD等抗氧化酶活性，清除丙二醛、過氧化氫和超氧陰離子等從而明顯提高果實的耐冷性[33–34]。然而，家族轉錄調節模式和功能豐富多樣甚至在部分物種間完全相反，胡椒()的并不參與冷脅迫過程，低溫敏感性的威廉蕉(sp.)低溫處理后POD活性甚至下調[35]。本試驗中，低溫處理早期表達量和POD活性整體水平大幅度上調，而表達量并未發生顯著變化，進一步驗證并非所有家族成員都能響應低溫誘導。此外，處理中后期表達量和POD活性均下降，與王允等[26]的研究結果相似。因此，POD同工酶參與了獼猴桃低溫貯藏早期的抗冷作用，然而這種響應機制只在部分家族成員中發揮調控。

大型機械壓力機大多為二到三級傳動結構，第一級為電動機通過皮帶帶動主軸轉動，第二級為主軸上的小齒輪帶動曲軸上的大齒輪轉動。從而通過曲柄滑塊機構驅動滑塊作上下往復的直線運動。因此大型機械壓力機傳動系統噪聲主要是齒輪副的噪聲。

本研究中，25℃室溫貯藏軟化過程中，POD活性也顯著提高，但只有略微上調表達。可見，這一過程可能存在這2個成員以外的其他POD同工酶編碼基因發生了轉錄水平改變。此外，試驗中所有處理的表達量均高于,說明可能在獼猴桃果實軟化、低溫響應和ABA誘導等過程中發揮比更為重要的調控功能。

[1] XU H H, YANG N, ZHAO J, et al. The wondrous kiwifruit: Origin, cultivation and utilization [J]. Int J Hort, 2017, 7(1): 1–6. doi: 10.5376/ ijh.2017.07.0001.

[2] CHEN Y T, CHENG C Z, LAI R L, et al. Research progress on factors influencing kiwifruit storage [J]. Fujian J Agric Sci, 2017, 32(2): 222– 227. doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2017.02.023.陳義挺, 程春振, 賴瑞聯, 等. 獼猴桃果實貯藏影響因子研究進展[J]. 福建農業學報, 2017, 32(2): 222–227. doi: 10.19303/j.issn.1008- 0384.2017.02.023.

[3] KASRAOUI M F, DUQUESNOY I, WINTERTON P, et al. Soluble and cell wall bound peroxidase activities are markers of flower bud development stages in lemon (L.) [J]. J Appl Bot Food Qual, 2014, 87: 1–8. doi: 10.5073/JABFQ.2014.087.001.

[4] FRANCOZ E, RANOCHA P, NGUYEN-KIM H, et al. Roles of cell wall peroxidases in plant development [J]. Phytochemistry, 2015, 112: 15–21. doi: 10.1016/j.phytochem.2014.07.020.

[5] WEVAR O A L, AGOSTINI E, TALANO M A, et al. Overexpression of a basic peroxidase in transgenic tomato (Mill. cv. Pera) hairy roots increases phytoremediation of phenol [J]. Plant Sci, 2005, 169(6): 1102–1111. doi: 10.1016/j.plantsci.2005.07. 007.

[6] XIE S. Effect of boron deficiency on lignin content and the key gene expression of lignin biosynthesis in two kinds citrus rootstocks [D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2014: 11–28.謝詩. 缺硼對兩種柑橘砧木木質素含量及其合成關鍵基因表達的影響[D]. 武漢: 華中農業大學, 2014: 11–28.

[7] HAO C M. Physiological biochemical mechanism of section dryingfruit during storage [D]. Chongqing: Southwest University, 2009: 18–34. 郝春梅. 柑桔貯藏期枯水的生理生化機理研究[D]. 重慶: 西南大學, 2009: 18–34.

[8] ZOLFAGHARI M, SAHARI M A, BARZEGAR M, et al. Physico- chemical and enzymatic properties of five kiwifruit cultivars during cold storage [J]. Food Bioprocess Technol, 2010, 3(2): 239–246. doi: 10.1007/s11947-008-0114-6.

[9] CHOU H N, NEE C C, OU A S M, et al. Characterization of the physico-chemical and antioxidant properties of Taiwanese kiwifruit () [J]. Bot Stud, 2008, 49: 215–224.

[10] ZHU S H, SUN L N, LIU M C, et al. Effect of nitric oxide on reactive oxygen species and antioxidant enzymes in kiwifruit during storage [J]. J Sci Food Agric, 2008, 88(13): 2324–2331. doi: 10.1002/jsfa.3353.

[11] WANG C H, MENG Q K, LIU X H, et al. Effect of 1-MCP treatment on ascorbic acid content and its quality, physiological of[J]. J Chin Inst Food Sci Technol, 2014, 14(5): 134–141.王春紅, 孟泉科, 劉興華, 等. 1-MCP處理對獼猴桃中抗壞血酸含量及其品質、生理的影響[J]. 中國食品學報, 2014, 14(5): 134–141.

[12] SONG L L, GAO H Y, CHEN H J, et al. Effects of short-term anoxic treatment on antioxidant ability and membrane integrity of postharvest kiwifruit during storage [J]. Food Chem, 2009, 114(4): 1216–1221. doi: 10.1016/j.foodchem.2008.10.080.

[13] SHEN Y G, WANG W, ZHANG W, et al. Hydrogen sulfide facilitating enhancement of antioxidant ability and maintainance of fruit quality of kiwifruits during low-temperature storage [J]. Trans Chin Soc Agric Eng, 2015, 31(z1): 367–372. doi: 10.3969/j.issn.1002–6819.2015.z1. 045.

[14] SUO J T, LI H, BAN Q Y, et al. Characteristics of chilling injury- induced lignification in kiwifruit with different sensitivities to low temperatures [J]. Postharv Biol Technol, 2018, 135: 8–18. doi: 10.1016/ j.postharvbio.2017.08.020.

[15] ZHENG X L, HU B, SONG L J, et al. Changes in quality and defense resistance of kiwifruit in response to nitric oxide treatment during storage at room temperature [J]. Sci Hort, 2017, 222: 187–192. doi: 10. 1016/j.scienta.2017.05.010.

[16] DU F M, ZHANG L Y, HE L, et al. Effect of quercetin treatment on storage of kiwifruit [J]. Shaanxi J Agric Sci, 2017, 63(7): 28–32.杜芳夢, 張麗媛, 何玲, 等. 槲皮素處理對獼猴桃貯藏的影響[J]. 陜西農業科學, 2017, 63(7): 28–32.

[17] LI H, LIANG C Q, Lü J, et al. Effects of oxalic acid treatment on lignification and related enzymes activities in ‘Huayou’ kiwifruit during cold storage [J]. Acta Hort Sin, 2017, 44(6): 1085–1093. doi: 10. 16420/j.issn.0513-353x.2016-0718.李樺, 梁春強, 呂茳, 等. 草酸對冷藏‘華優’獼猴桃果實木質化及相關酶活性的影響[J]. 園藝學報, 2017, 44(6): 1085–1093. doi: 10. 16420/j.issn.0513-353x.2016-0718.

[18] FANG L, JIANG B, ZHANG T. Effect of combined high pressure and thermal treatment on kiwifruit peroxidase [J]. Food Chem, 2008, 109 (4): 802–807. doi: 10.1016/j.foodchem.2008.01.017.

[19] BENLLOCH-TINOCO M, IGUAL M, RODRIGO D, et al. Comparison of microwaves and conventional thermal treatment on enzymes activity and antioxidant capacity of kiwifruit puree [J]. Innov Food Sci Emerg, 2013, 19: 166–172. doi: 10.1016/j.ifset.2013.05.007.

[20] CHEN K S, LI F, ZHANG S L, et al. Role of abscisic acid and indole- 3-acetic acid in kiwifruit ripening [J]. Acta Hort Sin, 1999, 26(2): 81– 86. doi: 10.3321/j.issn:0513-353X.1999.02.003.陳昆松, 李方, 張上隆, 等. ABA和IAA對獼猴桃果實成熟進程的調控[J]. 園藝學報, 1999, 26(2): 81–86. doi: 10.3321/j.issn:0513- 353X.1999.02.003.

[21] CHEN Y T, LAI R L, CHENG C Z, et al. Cloning and expression of polygalacturonase gene () during fruit softening of kiwifruit () [J]. J Agric Biotechnol, 2017, 25(2): 205–213. doi: 10.3969/j.issn.1674-7968.2017.02.004.陳義挺, 賴瑞聯, 程春振, 等. 獼猴桃果實軟化過程中基因的克隆與表達[J]. 農業生物技術學報, 2017, 25(2): 205–213. doi: 10. 3969/j.issn.1674-7968.2017.02.004.

[22] ZHAN J H, LAN Z H. Effects of external ABA on peroxidase isozyme of rice to low temperature stress [J]. Biotechnology, 2003, 13(1): 7–9. doi: 10.3969/j.issn.1004-311X.2003.01.005.詹嘉紅, 藍宗輝. 外源ABA對低溫脅迫水稻過氧化物酶同工酶的影響[J]. 生物技術, 2003, 13(1): 7–9. doi: 10.3969/j.issn.1004-311X. 2003.01.005.

[23] LATIF H H H. Physiological responses ofplant to exogenous ABA application under drought conditions [J]. Pak J Bot, 2014, 46(3): 973–982.

[24] WANG Y L, MA F W, LI M J, et al. Physiological responses of kiwifruit plants to exogenous ABA under drought conditions [J]. Plant Growth Regul, 2011, 64(1): 63–74. doi: 10.1007/s10725-010-9537-y.

[25] WANG Y, ZHANG Y, LIU C Y, et al. Effects of exogenous abscisic acid on active oxygen metabolism in ginger leaves under drought stress [J]. Acta Hort Sin, 2016, 43(3): 587–594. doi: 10.16420/j.issn.0513- 353x.2016-0034.王允, 張逸, 劉燦玉, 等. 干旱脅迫下外源ABA對姜葉片活性氧代謝的影響[J]. 園藝學報, 2016, 43(3): 587–594. doi: 10.16420/j.issn. 0513-353x.2016-0034.

[26] LI X M, ZHANG L H, HE X Y, et al. Effects of abscisic acid on photosynthetic characteristics and antioxidant enzyme activities of wheat seedlings exposed to UV-C [J]. Chin J ApplEcol, 2006, 17(5): 822–826.李雪梅, 張利紅, 何興元, 等. 脫落酸對UV-C脅迫下小麥幼苗光合特性及抗氧化酶活性的影響[J]. 應用生態學報, 2006, 17(5): 822–826.

[27] SHARMA A D, RAKHRA G, MEHTA S, et al. Accumulation of class-III type of boiling stable peroxidases in response to plant growth hormone ABA incultivars [J]. Plant Sci Today, 2014, 1(1): 3–9. doi: 10.14719/pst.2014.1.1.6.

[28] GUO X H, JIANG J, WANG B C, et al., a truncated polypeptide from, conferred drought tolerance in[J]. Mol Biol Rep, 2010, 37(3): 1183–1190. doi: 10.1007/s11033-009- 9484-8.

[29] WANG C J, CHAN Y L, SHIEN C H, et al. Molecular characterization of fruit-specific class III peroxidase genes in tomato () [J]. J Plant Physiol, 2015, 177: 83–92. doi: 10.1016/j.jplph. 2015.01.011.

[30] SU Y C, WANG Z Q, LI Z, et al. Molecular cloning and functional identification of peroxidase geneJ]. Acta Agron Sin, 2017, 43(4): 510–521. doi: 10.3724/SP.J.1006.2017.00510.蘇亞春, 王竹青, 李竹, 等. 甘蔗過氧化物酶基因的克隆與功能鑒定[J]. 作物學報, 2017, 43(4): 510–521. doi: 10.3724/SP.J. 1006.2017.00510.

[31] BURDON J, LALLU N, FRANCIS K, et al. The susceptibility of kiwifruit to low temperature breakdown is associated with pre-harvest temperatures and at-harvest soluble solids content [J]. Postharv Biol Technol, 2007, 43(3): 283–290. doi: 10.1016/j.postharvbio.2006.09.011.

[32] YANG Q Z, RAO J P, YI S C, et al. Antioxidant enzyme activity and chilling injury during low-temperature storage of kiwifruit cv. Hong- yang exposed to gradual postharvest cooling [J]. Hort Environ Bio- technol, 2012, 53(6): 505–512. doi: 10.1007/s13580-012-0101-8.

[33] YANG Q Z, ZHANG Z K, RAO J P, et al. Low-temperature condi- tioning induces chilling tolerance in ‘Hayward’ kiwifruit by enhancing antioxidant enzyme activity and regulating endogenous hormones levels [J]. J Sci Food Agric, 2013, 93(15): 3691–3699. doi: 10.1002/ jsfa.6195.

[34] ZHANG Q, ZHANG J Z, CHOW W S, et al. The influence of low temperature on photosynthesis and antioxidant enzymes in sensitive banana and tolerant plantain (sp.) cultivars [J]. Photosynthetica, 2011, 49(2): 201–208. doi:10.1007/s11099-011-0012-4.

[35] WANG J E, LIU K K, LI D W, et al. A novel peroxidasegene of pepper is involved in defense responses toinfection as well as abiotic stress tolerance [J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(2): 3158–3177. doi: 10.3390/ijms14023158.

Cloning and Expression Analysis ofGenes in Kiwifruit

CHEN Yi-ting1, LAI Rui-lian1, FENG Xin1, GAO Min-xia1, CHENG Chun-zhen2, CHEN Wen-guan, WU Ru-jian1*

(1. Fruit Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China;2. Institute of Horticultural Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

To understand the regulation function of peroxidase genes in kiwifruit, two members ofgene family (and) were clonedfrom‘Miliang-1’ by using reverse transcription PCR, the bioinformations of AdPOD27 and AdPOD64 were analyzed, and the correlation between their expression and POD activity were also studied.The results showed that the length of open read frame ofandwas 984 and 957 bp, encoding 327 and 318 amino acids, respectively, which GenBank accession No. were MF774100 and MF774101. AdPOD27 and AdPOD64 were hydrophilic and alkaline proteins belonging to class III of the plant heme-dependent peroxidase superfamily. The two proteins had signal peptide, transmembrane structure and phosphorylation sites. AdPOD27 and AdPOD64 located in mitochondrion and extracellular region, respectively. qRT-PCR analysis showed that the expression ofwas up-regulated greatly treated with abscisic acid (ABA) and under 4℃, whileexpression only enhanced treated with ABA. Moreover, theexpression had significant correlations with POD activity andexpression. Therefore,andwould be involved in fruit softening, low temperature response and ABA induction of.

Kiwifruit; Peroxidase; Fruit softening; Low temperature; Abscisic acid

10.11926/jtsb.3919

2018-04-04

2018-07-02

福建省自然科學基金項目(2017J01044, 2018J05051); 福建省農業科學院博士科研啟動基金項目(DC2017-2); 福建省農業科學院科技創新團隊項目(STIT2017-3-6); 福建省公益類科研院所基本科研專項(2015R1014-3)資助

This work was supported by the Natural Science Foundation in Fujian (Grant No. 2017J01044, 2018J05051), the Doctoral Research Starting Fund of Fujian Academy of Agricultural Sciences (Grant No. DC2017-2), the Project for Science and Technology Innovation Group of Fujian Academy of Agricultural Sciences (Grant No. STIT2017-3-6), the Project for Basic Science and Technology of Public Welfare Scientific Research Institution in Fujian Province (Grant No. 2015R1014-3).

陳義挺(1972~ )，男，博士，副研究員，研究方向為果樹生物技術與遺傳資源。E-mail: chyiting@163.com

E-mail: wurujian@126.com