基于RAD-SNPs分析的四川核桃良種資源的遺傳多樣性研究

閆思宇, 朱鵬, 龔偉*, 王景燕, 吳開志, 吳春艷, 李海平, 龔毅紅, 段瓊

?

基于RAD-SNPs分析的四川核桃良種資源的遺傳多樣性研究

閆思宇1*, 朱鵬1*, 龔偉1**, 王景燕1, 吳開志2, 吳春艷2, 李海平2, 龔毅紅2, 段瓊2

(1. 四川農業大學林學院, 成都 611130; 2. 四川省林木種苗站, 成都 610081)

為了解四川核桃()種質資源的遺傳多樣性，利用RAD二代測序技術對42份核桃良種資源進行測序，分析其遺傳結構和遺傳多樣性。結果表明，共獲得70G clean data，Q30平均為96.3%，并獲得160 309個多態性SNPs。聚類、遺傳結構和主成分分析結果高度一致，42份種質資源聚為兩大類，基本反映了兩個原始祖先血統，即普通核桃類(AJR，33份)和泡核桃類(AJS，9份)，兩類群具較高的遺傳分化(ST=0.285)，且分類與地理位置分布和種群相關；且修正了‘威薄01’、‘白龍1號’和‘石棉巨核’3個品種的類群認定。AJS和AJR類群中分別有9和14個良種為純血統且親緣關系較遠，而其余的良種均為兩個血統的混雜。42個核桃良種資源的核苷酸多樣性[P()]和期望雜合度()分別為0.029和0.286，表明這些資源具有豐富的遺傳多樣性，相對于AJR類群，AJS類群的雜合率()與核苷酸多態性更大，而SNP數更少，AJS遺傳多樣性更豐富。這些為四川的核桃種質資源保存和雜交育種研究奠定了基礎。

RAD-SNP；普通核桃；泡核桃；遺傳多樣性

植物種質資源是生產發展的基礎性、戰略性資源，是良種選育的原始材料、品種改良的物質基礎，種質資源擁有的數量和研究的深入程度是決定育種效果的關鍵[1]。種質資源保護和保存的本質是遺傳多樣性的保護和保存，因此種質資源保護與保存是否有效，關鍵在于對種質資源的遺傳類群、遺傳關系、遺傳多樣性等遺傳背景信息的研究和評估。核桃為胡桃科(Juglandaceae)核桃屬()植物,具有用途多樣、營養豐富、口味獨特的特點，是世界著名的堅果類和木本油料樹種之一[2–3]，在人類健康和世界經濟貿易發展中有著重要的作用[4]。核桃屬含4組約21種，其中普通核桃()與泡核桃()為核桃組中的兩姐妹種，是目前栽培最為廣泛的兩種核桃(作為干果食用)[5–7]。中國的核桃遺傳資源十分豐富，各種類型和品種多達4 000多個，而經選育形成的優良品種或無性系就達到500余個[2]。四川是中國主要的核桃遺傳資源分布和栽培省份之一，也是泡核桃和普通核桃共存的適生區域，蘊藏著豐富的核桃遺傳資源[2,6]。近年來，隨著一大批引進和本地選育優良核桃品種在生產中的使用，四川的核桃產業得到了快速的發展。為了更好地發揮核桃良種資源在生產和育種上的潛力，四川省林業廳組織全省相關的核桃研究和生產單位對目前四川范圍內引進和選育的核桃良種資源進行了收集和保存，建立了四川省的核桃良種種質資源庫，但要真正有效地利用和發揮這些核桃良種種質資源的遺傳潛力，就需要對種質資源的遺傳類群、遺傳關系、遺傳多樣性等在內的遺傳背景信息開展系統的研究和評估。

利用分子標記評價核桃遺傳多樣性，如限制性內切酶片段長度多態性標記[8](restriction fragment length polymorphism, RFLP)、隨機擴增多態性DNA標記[9](random amplified polymorphic DNA, RAPD)、擴增片段長度多態性標記(amplified fragment length polymorphism, AFLP)[10]和微衛星DNA標記(micro- satellite DNA, SSR)[11]，已得到廣泛的使用。然而這些傳統分子標記的位點數量普遍偏少，獲得的遺傳結構和遺傳多樣性信息有限[12]。單核苷酸多態性標記(single nucleotide polymorphisms, SNP)是二等位基因，代表基因組中最小的遺傳變異單元，在基因組中密度高、分布均勻，數據統計簡單、準確，不存在數據兼容性問題[13]，被國際植物新品種保護聯盟用于對農作物進行DUS (distinctness, uniformity and stability)測試。尤其是近年來測序技術的快速進步使得獲取大量SNPs變得高效而低廉，限制性內切酶酶切位點DNA測序(restriction-site associated DNA sequencing, RAD-seq)技術就是其中之一，操作簡單，性價比高，可獲得數以萬計的SNP標記，已廣泛用于對非模式物種的研究[14–15]。為此，本研究采用RAD-seq技術對核桃良種種質資源進行測序，同時以NCBI上全長700 Mb的‘Chandler’為參考基因組序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/? term=Juglans%20regia)進行比對分析，通過獲取多態性SNPs對四川省收集的42份核桃良種種質資源進行遺傳背景信息分析和研究，期望驗證種質資源庫對核桃種類的認定，了解核桃種質資源的遺傳構成、遺傳關系和遺傳多樣性。通過確定品種準確的遺傳分群，揭示品種間的遺傳關系，為篩選并保存優良種質資源奠定基礎，也為未來進一步的雜交育種減少盲目性，同時為四川地區核桃種質資源的遺傳多樣性及遺傳背景的分析提供重要的參考價值, 對四川的核桃育種工作提供重要的理論指導。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料為經四川省林木品種審定委員會審(認)定的42個核桃良種(表1)，其中6個為北方引進品種、3個為云南引進品種、4個為本地雜交品種，其余都是通過對四川野生或長期栽培的核桃進行選育的品種(http://www.sclmzm.com:88/sczmz/linmuliangzhong/index.jhtml)。北方品種是利用北方核桃直接選育或雜交后選育出的[16–17]，云南品系為新疆核桃與云南的漾濞核桃(泡核桃)、三臺核桃和華寧核桃等雜交選育出的云新系列[18–19]，本地雜交核桃是云新系列與四川盆地本地核桃的雜交品種[20–22]。于2016年5月上旬在四川農業大學崇州基地分別采集各品種的嫩葉，采集前用100%酒精消毒、清洗，采集后放入冰盒保鮮，立即帶回實驗室進行DNA提取。

表1 42個供試核桃良種

1.2 基因組DNA的提取

加入4%~6%聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrro- lidone, PVP)和液氮研磨嫩葉，采用寶生物植物DNA提取試劑盒(TaKaRa, Dalian)提取核桃基因組DNA。提取的DNA采用瓊脂糖凝膠電泳和ND- 2000分光光度計檢驗DNA的質量和濃度，將合格的樣品送于上海美吉生物醫藥科技有限公司進行RAD-seq簡化基因組測序。

1.3 文庫構建和測序

利用酶切預測軟件對參考基因組進行酶切預測，選擇酶切效果最佳的內切酶I(TCGA Thermo- fisher)進行后續實驗。對檢測合格的樣品基因組DNA以總量800 ng參照Baird等[23]進行酶切文庫構建，文庫質檢合格后用Illumina HiseqTM平臺進行測序，測序策略為Illumina PE150。為評估建庫實驗的準確性，選用水稻()作為對照參與建庫和測序。為了保證測序質量，對‘涼林119’與‘白龍1號’進行了兩次測序，通過比對結果分析進行內部控制數據質量，因此共進行了44份材料的測序。測序數據進行質量過濾，并對過濾前后的測序reads數、總堿基數、Q30和平均測序深度進行統計。

1.4 SNP標記開發

運用BWA 軟件[24]將質控后的reads與參考基因組序列進行比對，再利用GATK軟件[25]消除假陽性SNP和Samtools軟件[26]提供的vcfutils工具過濾掉測序深度和比對質量值較低的位點，過濾標準為：① 選取基因組中的非重復區(避免轉座元件),并映射在參考基因組上的reads (避免非特異性擴增)；② 只保留雙等位基因頻率范圍在40%~60%的SNPs；③ 相鄰的SNPs至少相隔50 kb；④ 篩選掉樣品分型結果中次要等位基因頻率MAF<0.05的位點；⑤ 篩選基因型至少覆蓋所有樣本60%以上個體的標記 (該標準根據實際標記數據量進行適當調整)，即對于單個多態性標記位點，100個樣本中至少有60個樣本有確定基因型。通過對基因型完整性覆蓋情況差的標記進行過濾，最終得到的SNP標記用于后續分析。

1.5 遺傳結構分析

通過RAxML軟件[27]的maximum likelihood算法構建進化樹，使用模型為GTRGAMMA, bootstrap 1 000次；通過STRUCTURE v2.3.4[28]軟件，分析遺傳結構，假設樣本的分群數(K值)為1~10，使用貝葉斯算法推算在具體分群數下每個個體的血統構成情況。根據CV error (cross validation error)最低點對應的K值來確定最佳分群數。通過GCTA軟件[29]進行主成分分析(principal components analysis, PCA)分析，得到樣本的主成分聚類情況，用于輔助遺傳結構分析。

1.6 遺傳多樣性分析

根據對42個樣本的遺傳結構分析結果，對類群的遺傳多樣性進行分析，包括核苷酸多樣性[P()]、群體期望雜合度()等。核苷酸多樣性采用PopGenome軟件[30]進行計算，期望雜合度為每個位點雜合樣數目與所有樣本數目之比，然后將所有位點的雜合率相加，取平均值。

2 結果和分析

2.1 測序結果和SNP開發

對44份材料進行測序，共獲得70G clean data，Q30平均為96.3%，GC含量平均為43.0% (數據集1)，樣本測序深度為23×~64×(數據集3)。所有樣本定位到參考基因組上的clean reads數占所有去重復clean reads數的88.6%，同時符合測序片段長度的reads數占所有clean reads的74.7% (數據集1)。

以核桃‘Chandler’品種為參考基因組序列進行比對，共獲得7 360 659個SNPs (數據集2)。經過假陽性消除和基因型完整性覆蓋過濾后，共獲得160 309個高一致性的群體SNPs，其中有6 357個測序深度在所有樣品中都超過10×。160 309個SNPs被定位到“Chandler”基因組序列(105811個)的4743個片段上，其中有1 116個SNPs定位到LIHL01055144片段，為含量最多的片段。基因間隔區、外顯子、下游、上游和ncRNA外顯子(ncRNA-exonic)分別含有的SNPs為158 049 (98.6%)、928 (0.6%)、479 (0.3%)、764 (0.5%)和89 (0.1%)。其中外顯子含有的928個SNPs中，同義SNV (single-nucleotide variant)和非同義SNV分別為319 (34.4%)和375 (40.4%)(數據集4)。

2.2 遺傳結構分析

聚類分析(圖1)表明，42個品種和‘Chandler’品種比較明顯地聚為兩大類群：第一類群包含9個品種(標為AJS)，除‘威薄01’外，其余品種均隸屬于泡核桃[(JS)]；‘Chandler’和另外33個品種聚為第二類群(標為AJR)，除‘白龍1號’和‘石棉巨核’外，其余品種均隸屬于普通核桃[(JR)]。基于Structure軟件分析的遺傳結構結果表明，當分類群數K=2時的CV-error最小(圖2), 表明42個樣品可能主要存在兩類血統來源[18]。具體分析分類群數K=2時42個品種的血統來源(圖3)，AJS類群中的‘香酥’、‘康烏1號’、‘雷溪’、‘涼林119’和‘冕漾’等5個品種為完全的純藍色血統(標為AJS-2)，其余4個品種混雜有部分紫色血統(標為AJS-1)；AJR類群中有14個品種為完全的純紫色血統(標為AJR-2)，其余品種均為紫色和藍色血統的混雜(標為AJR-1)。PCA分析結果與聚類分析、Structure分析結果具有相當的匹配性，42個品種也可分為兩大類群4個亞群(圖4)，同時根據解釋比例最高(占19.2%)的主成分PC1，4個亞群呈一定的梯度排列，依次為AJS-2、AJS-1、AJR-1和AJR-2，即表現出從純正的祖先血統I→雜合血統→祖先血統II的梯度關系，AJS-2和AJR-2兩亞群相距最遠，遺傳結構差異性最大，親緣關系最遠。

2.3 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析表明，AJS類群的品種數雖然要少于AJR類群，但AJS類群的核苷酸多樣性[P()]和期望雜合度(He)都高于AJR類群，AJS類群分別為0.030和0.308，AJR類群分別為0.027和0.278，而42份核桃種質的核苷酸多樣性和期望雜合度介于兩個類群之間，分別為0.029和0.286，具較高的遺傳多樣性。

3 討論和結論

隨著植物全基因組序列研究工作的廣泛開展, SNP標記已開始廣泛地應用于植物的遺傳分析[31–32]。有研究表明，低等到中等RAD測序均可應用于非模式物種種群基因組的探索[4,23]。核桃是雌雄同株異花，多異交，可天然雜交，在種群內保持著多樣化的基因型[2–3]。通過群體DNA池開發的SNP較從單個個體開發的標記對于研究遺傳多樣性的效果更佳[33]。本研究中，普通核桃與泡核桃通過共同使用RAD策略進行基因組測序，并對‘涼林119’和‘白龍1號’重復測序，從內外部進行數據質量控制,排除物種或限制酶干擾，從而保證測序質量。‘涼林119’和‘白龍1號’兩次測序個體間的遺傳距離存在邊際效應(<0.005)，這可能與分析處理中數據(不包括冗余數據)非對稱丟失有關[14]。本研究中，每個樣本測序數據量均較高(測序深度為23×~64×), 而160 309個高一致性的群體SNPs中有6 357個測序深度在所有樣本中都超過了10×，高于Xu等[14]報道葫蘆()的RAD-seq平均測序深度，因此對42個品種開展的遺傳分析具有較好的可信度。

聚類分析結果表明，42個核桃品種和‘Chandler’品種聚為兩大類群，結構分析也表明兩個類群是最優的分類群數，且除內江威遠的‘威薄1號’、雅安石棉的‘石棉巨核’和涼山會理的‘白龍1號’外，各品種也基本符合原有認定的普通核桃和泡核桃的分類。根據STRUCTURE和PCA的分析結果，兩大類群又可分別分為兩個亞群，即純血統和混雜血統兩個亞群，其中純血統普通核桃為6個北方引進品種、2個阿壩黑水優選品種和其他一些盆地優選品種，純血統泡核桃都是川西山地品種。可以看到,四川盆地的優選核桃除‘威薄1號’外均與此前的分類一致，更多的是屬于北方核桃的普通核桃類群或血統。根據核桃的地理起源考證，普通核桃可能起源于西亞和我國北方地區(尤其是新疆地區)，而后主要由于人為活動而被傳播到現在的主要栽培區[3,34],四川盆地至少早在漢代以前就與北方地區有著十分頻繁的交流，普通核桃也因此很可能作為優良的堅果經濟林而被引入栽培，根據四川的地形地貌和生態氣候條件，四川核桃傳統上被分為東部盆地區的川東亞群和西部山地區的川西亞群[2]，但本研究結果中阿壩黑水和廣元青川核桃并沒有和其他川西核桃聚為一個類群，而是與川東亞群和北方核桃等聚為一個類群。Wang等[35]在對我國8個野生核桃種群進行遺傳分析時，也認為黑水的核桃種群與華北地區的核桃種群聚為一類，顯示其與北方核桃有更近的血緣關系，這很可能也是因為歷史上該地區與盆地地區比涼山地區有更為頻繁的交流有關。雅安市南部大相嶺以南的涼山地區是泡核桃的原產分布區之一[3,36]，該地區優選的核桃除‘鹽源早’、‘石棉巨核’和‘白龍1號’都歸屬于泡核桃類群，也基本符合此前的分類。‘鹽源早’雖然優選于泡核桃原產分布區的涼山鹽源縣，但根據其形態特征以及鹽源縣近年的核桃栽培和發展歷史，曾被認定為普通核桃[37]，本研究予以證實。雅安石棉優選的‘石棉巨核’和涼山會理優選的‘白龍1號’此前雖然被認定為泡核桃，但它們的形態特征偏向于普通核桃而一直被懷疑[38]，本研究無論是聚類還是血統分析結果表明，它們更應該屬于普通核桃而非認定的泡核桃。在此前認定為普通核桃的品種中，內江威遠優選的‘威薄1號’是唯一1個被歸為泡核桃的品種,根據Structure的血統分析，其泡核桃血統超過了60%，因此該品系歸于泡核桃比較合理[39]。

核苷酸多樣性是反映物種種內DNA序列變異程度的重要參數[40–43]。模式植物擬南芥()基于334個SNP位點和水稻()基于111個SNP位點的核苷酸多樣性指數分別為0.007和0.003 2[43–44]，木本植物的核苷酸多樣性指數多為0.001 86~0.016[45]，挪威云杉()基于22個位點的核苷酸多樣性指數為0.003 99[46],毛果楊()基于全基因組SNPs的核苷酸多樣性指數為0.016[47]，凹葉木蘭()基于7個SNP位點的核苷酸多樣性指數為0.017 8[41]。在本研究中，42個核桃品系基于簡化基因組SNPs的核苷酸多樣性指數達0.029，遠高于許多木本植物，顯示這42份核桃種質資源具有較為豐富的遺傳多樣性。在期望雜合度方面，本研究42個品種的總體期望雜合度()為0.278，與多種物種基于SNP的期望雜合度相比處于中上水平, 如短花針茅(, 0.131)、(0.269~0.303)[48]、葡萄(, 0.340)[49]等。對比Han[50]的研究結果，本研究中核桃群體期望雜合度相對更低，可能由于SNP的等位基因一般遠少于SSR標記，因此基于SNP的期望雜合度也低于基于SSR標記的群體期望雜合度，與葡萄的研究結果相似[49]。泡核桃類群的樣本數遠低于普通核桃類群，但其核苷酸多樣性(0.030)和期望雜合度(0.308)都要略高于普通核桃類群(0.027和0.278), 顯示出更高的遺傳多樣性。相對于普通核桃，泡核桃的原產地區地理條件險峻惡劣，歷史上經濟發展也十分滯后，且泡核桃本身的食用品質較差，因此一般都是以野生方式存在，很少經歷人為的馴化和選育，可能是導致泡核桃類群在個體數較少的情況下仍然具有較高遺傳多樣性的原因[51–52]。

本研究采用RAD-seq技術對42份核桃良種種質資源進行測序，獲得160 309個高一致性的SNPs，遺傳分析表明，42個核桃良種基本符合此前的分類認定，分為普通核桃和泡核桃兩大類群，且兩大類群又可細分為血統較純和較混雜的兩個亞群，其中普通核桃純血統亞群主要包括北方引進品種和阿壩黑水品種等，泡核桃純血統亞群都是涼山地區選育品種，而云南引進的雜交品種和本地雜交品種都屬于普通核桃混雜血統亞群。根據遺傳類群劃分對3個核桃品種‘威薄01’、‘石棉巨核’和‘白龍1號’之前的類群認定進行了修正，‘威薄01’修正為泡核桃，而‘石棉巨核’和‘白龍1號’修正為普通核桃。從核苷酸多樣性指數和期望雜合度來看，42份核桃種質資源具有較為豐富的遺傳多樣性，且泡核桃類群的遺傳多樣性略高于普通核桃類群。因此，該批良種種質資源可以為開展四川核桃育種提供良好的遺傳資源和物質基礎，同時也為四川省核桃種質資源的區劃、保護及利用提供理論依據。

[1] ZHANG T. Research on genetic diversity of tobacco germplasm resource [J]. Serv Agric Technol, 2010, 27(1): 101-103. 張艇. 煙草種質資源的遺傳多樣性研究 [J]. 農技服務, 2010, 27(1): 101-103.

[2] XI R T, ZHANG Y P. Flora of China Fruit Tree, Volume Walnut [M]. Beijing: China Forestry Publishing House, 1996: 28-53,84-91.郗榮庭, 張毅萍. 中國果樹志, 核桃卷 [M]. 北京: 中國林業出版社, 1996: 28-53,84-91.

[3] XI R T, ZHANG Y P. China Walnut [M]. Beijing: China Forestry Publishing House, 1992: 111-117. 郗榮庭, 張毅萍. 中國核桃 [M]. 北京: 中國林業出版社, 1992: 111–117.

[4] BAGHKHEIRATI E K, BAGHERIEH-NAJJAR M B. Modelling and optimization of Ag-nanoparticle biosynthesis mediated by walnut green husk extract using response surface methodology [J]. Mat Lett, 2016, 171: 166-170. doi: 10.1016/j.matlet.2016.01.159

[5] ARADHYA M K, POTTER D, GAO F Y, et al. Molecular phylogeny of(Juglandaceae): A biogeographic perspective [J]. Tree Genet Gen, 2007, 3(4): 363-378. doi: 10.1007/s11295-006-0078-5.

[6] PU G L, XIAO Q W, WU K Z, et al. Research on the phenotypic diversity of walnut germplasm resources in Sichuan [J]. J Hunan Agric Univ (Nat Sci), 2014, 40(2): 162-167. doi: 10.13331/j.cnki.jhau.2014. 02.011.蒲光蘭, 肖千文, 吳開志, 等. 四川核桃種質資源表型多樣性研究 [J]. 湖南農業大學學報(自然科學版), 2014, 40(2): 162-167. doi: 10. 13331/j.cnki.jhau.2014.02.011.

[7] PEI D, LU X Z. Walnut Germplasm Resources in China [M]. Beijing: Chinese Forestry Press, 2011: 25-28. 裴東, 魯新政. 中國核桃種質資源 [M]. 北京: 中國林業出版社, 2011: 25-28.

[8] FJELLSTROM R G, PARFITT D E. Phylogenetic analysis and evolu- tion of the genus(Juglandaceae) as determined from nuclear genome RFLPs [J]. Plant Syst Evol, 1995, 197(1/2/3/4): 19-32. doi: 10. 1007/BF00984629.

[9] NICESE F P, HORMAZA J I, MCGRANAHAN G H. Molecular characterization and genetic relatedness among walnut (L.) genotypes based on RAPD markers [J]. Euphytica, 1998, 101(2): 199-206. doi: 10.1023/A:1018390120142.

[10] BAYAZIT S, KAZAN K, GULBITTI S, et al. AFLP analysis of genetic diversity in low chill requiring walnut (L.) genotypes from Hatay, Turkey [J]. Sci Hort, 2007, 111(4): 394-398. doi: 10.1016/ j.scienta.2006.11.006.

[11] DANGL G S, WOESTE K, ARADHYA M K, et al. Characterization of 14 microsatellite markers for genetic analysis and cultivar identification of walnut [J]. J Amer Soc Hort Sci, 2005, 130(3): 348–354.

[12] WANG W, ZHOU W Z. Efficient extraction and application of total RNA in sisal [J]. Chin J Trop Crops, 2008, 29(6): 725–729. doi: 10. 3969/j.issn.1000-2561.2008.06.010.王尉, 周文釗. 劍麻核酸的高效提取及應用[J]. 熱帶作物學報, 2008, 29(6): 725–729. doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2008.06.010.

[13] LI X, TIAN H L, WANG F G, et al. Comparison of SSR and SNP markers in maize varieties genuineness identification [J]. Mol Plant Breed, 2014, 12(5): 1000–1004. doi: 10.13271/j.mpb.012.001000.李雪, 田紅麗, 王鳳格, 等. SSR和SNP兩種標記技術在玉米品種真實性鑒定中的比較分析 [J]. 分子植物育種, 2014, 12(5): 1000– 1004. doi: 10.13271/j.mpb.012.001000.

[14] XU P, XU S Z, WU X H, et al. Population genomic analyses from low- coverage RAD-Seq data: A case study on the non-model cucurbit bottle gourd [J]. Plant J, 2014, 77(3): 430–442. doi: 10.1111/tpj.12370.

[15] van WYNGAARDEN M, SNELGROVE P V R, DIBACCO C, et al. Identifying patterns of dispersal, connectivity and selection in the sea scallop,, using RAD-seq derived SNPs [J]. Evol Appl, 2017, 10(1): 102–117. doi: 10.1111/eva.12432.

[16] CHEN S B, YU Z J, YANG W Y, et al. Introduction and cultivation techniques of Qingxiang walnut in Sichuan [J]. S China Fruit, 2016, 45 (2): 156–160. doi: 10.13938/j.issn.1007-1431.20150532. 陳善波, 余忠江, 楊文淵, 等. 清香核桃在四川的引種表現及栽培技術 [J]. 中國南方果樹, 2016, 45(2): 156–160. doi: 10.13938/j.issn. 1007-1431.20150532.

[17] FENG Y C, YANG S X, DONG S G, et al. An investigation of the introduction offrom Xinjiang in Lixian County in the arid valleys of the upper Minjiang River [J]. J Sichuan For Sci Technol, 2010, 31(3): 110–112. doi: 10.3969/j.issn.1003-5508.2010.03.020.馮云超, 楊素香, 董生剛, 等. 岷江上游干旱河谷理縣新疆核桃引種調查 [J]. 四川林業科技, 2010, 31(3): 110–112. doi: 10.3969/j.issn. 1003-5508.2010.03.020.

[18] PAN J, ZHANG G S. Breeding report ofבShuxing 1’ and ‘Shuxing 6’ [J]. China For Ind, 2016(7): 290. 潘濟, 張光勝. 蜀興1號、6號核桃良種選育報告 [J]. 中國林業產業, 2016(7): 290.

[19] FANG W L, YANG Z B, HUANG Q, et al. Selective breeding of precocious, prolific and quality walnut strains [J]. Nonwood For Res, 1998(1): 6–10. 方文亮, 楊振幫, 黃謙, 等. 核桃早實、豐產、優質雜交新品系的選育研究[J]. 經濟林研究, 1998(1): 6–10.

[20] ZHOU L Y, PU G L, XIAO Q G, Study on the photosynthetic and physiological hybrid vigor of walnut [J]. N Hort, 2009(10): 41–44. 周蘭英, 蒲光蘭, 肖前剛. 核桃雜交后代光合生理優勢研究 [J]. 北方園藝, 2009(10): 41–44.

[21] PU G L, XIAO Q W, ZHOU L Y. A New early-fruiting walnut cultivar ‘Chuanzao 1’ [J]. Acta Hort Sin, 2011, 38(10): 2025–2026. doi: 10. 16420/j.issn.0513-353x.2011.10.025.蒲光蘭, 肖千文, 周蘭英. 早實核桃新品種‘川早1號’ [J]. 園藝學報,2011, 38(10): 2025–2026. doi: 10.16420/j.issn.0513-353x.2011.10.025.

[22] XIAO Q W, XIAO Q G, ZHOU L Y, et al. A new early-maturing and thin shell walnut cultivar ‘Shuangzao’ [J]. Acta Hort Sin, 2013, 40(1): 179–180. doi: 10.16420/j.issn.0513-353x.2013.01.020.肖千文, 肖前剛, 周蘭英, 等. 早熟薄皮核桃新品種‘雙早’ [J]. 園藝學報, 2013, 40(1): 179–180. doi: 10.16420/j.issn.0513-353x.2013.01. 020.

[23] BAIRD N A, ETTER P D, ATWOOD T S, et al. Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers [J]. PLoS One, 2008, 3(10): e3376. doi: 10.1371/journal.pone.0003376.

[24] LI H, DURBIN R. Fast and accurate short read alignment with Burrows- Wheeler transform [J]. Bioinformatics, 2009, 25(14): 1754–1760. doi: 10.1093/bioinformatics/btp324.

[25] McKENNA A, HANNA M, BANKS E, et al. The genome analysis toolkit: A mapreduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data [J]. Genome Res, 2014, 20(9): 1297–1303. doi: 10. 1101/gr.107524.110.

[26] LI H, HANDSAKER B, WYSOKER A, et al. Genome project data processing S: The sequence alignment/map format and samtools [J]. Bioinformatics, 2009, 25(16): 2078–2079. doi: 10.1093/bioinformatics/ btp352.

[27] STAMATAKIS A. RAxML version 8: A tool for phylogenetic analysis and post-analysis of large phylogenies [J]. Bioinformatics, 2014, 30(9): 1312–1313. doi.org/10.1093/bioinformatics/btu033.

[28] FALUSH D, STEPHENS M, PRITCHARD J K. Inference of population structure using multilocus genotype data: Linked loci and correlated allele frequencies [J]. Genetics, 2003, 164(4): 1567–1587. doi: 10.3410/ f.1015548.197423.

[29] YANG J, LEE S H, GODDARD M E, et al. GCTA: A tool for genome- wide complex trait analysis [J]. Amer J Hum Genet, 2011, 88(1): 76–82. doi: 10.1016/j.ajhg.2010.11.011.

[30] PFEIFER B, WITTELSBURGER U, RAMOS-ONSINS S E, et al. PopGenome: An efficient Swiss army knife for population genomic analyses in R [J]. Mol Biol Evol, 2014, 31(7): 1929–1936. doi: 10. 1093/molbev/msu136.

[31] Brown G R, Gill G P, Kuntz R J, et al. Nucleotide diversity and linkage disequilibrium in loblolly pine [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(42): 15255–15260. doi: org/10.1073/pnas.0404231101.

[32] INGVARSSON P K. Nucleotide polymorphism and linkage dise- quilibrium within and among natural populations of European aspen (L., Salicaceae) [J]. Genetics, 2005, 169(2): 945–953. doi: org/10.1534/genetics.104.034959.

[33] POLLEGIONI P, WOESTE K E, CHIOCCHINI F, et al. Ancient humans influenced the current spatial genetic structure of common walnut populations in Asia [J]. PLoS One, 2015, 10(9): e0135980. doi: 10.1371/journal.pone.0135980.

[34] YAN Z F, SHANG X Y. Studies on classification of walnut in Xinjiang [J]. Xinjiang Agric Sci, 1987(5): 25–26. 嚴兆福, 尚新業. 新疆核桃分類的探討 [J]. 新疆農業科學, 1987(5): 25–26.

[35] WANG H, PEI D, GU R S, et al. Genetic diversity and structure of walnut populations in central and southwestern China revealed by microsatellite markers [J]. J Amer Soc Hort Sci, 2008, 133(2): 197– 203.

[36] SUN Y W. History and resources of Chinese fruit tree [M]. Shanghai: Shanghai Scientific & Technical Publishers, 1983: 12–13. 孫云蔚. 中國果樹史與果樹資源 [M]. 上海: 上海科學技術出版社, 1983: 12–13.

[37] WANG S D, MAO G H, HU C L, et al. Grafting techniques of improving wild low-yield and low-quality walnut trees in Yanyuan County [J]. J Sichuan For Sci Technol, 2010, 31(3): 97–101,70. doi: 10. 3969/j.issn.1003-5508.2010.03.017.王仕娣, 毛國慧, 胡聰林, 等. 鹽源縣低產低質野生核桃改良嫁接技術試驗[J]. 四川林業科技, 2010, 31(3): 97–101,70. doi: 10.3969/ j.issn.1003-5508.2010.03.017.

[38] SUN Q, XIAO Q W, LUO Y F, et al. Research on the main economic characters of the giant walnut in Shimian [J]. N Hort, 2011(18): 15–18. 孫權, 肖千文, 羅永飛, 等. ‘石棉巨型’核桃主要經濟性狀研究 [J]. 北方園藝, 2011(18): 15–18.

[39] WU C L, ZHANG Q Q, DONG B X, et al. Analysis of genetic structure and genetic relationships of partial maize inbred lines in China [J]. Acta Agric Sin, 2010, 36(11): 1820–1831. doi: 10.3724/SP. J.1006.2010.01820.吳承來, 張倩倩, 董炳雪, 等. 我國部分玉米自交系遺傳關系和遺傳結構解析 [J]. 作物學報, 2010, 36(11): 1820–1831. doi: 10.3724/ SP.J.1006.2010.01820.

[40] XU G B. Genetics of Plant Population [M]. Beijing: Science Press, 2009: 197-198. 徐剛標. 植物群體遺傳學 [M]. 北京: 科學出版社, 2009: 197-198.

[41] WANG J Y, WU C F, TANG Y. Preliminary study on genetic diversity of(Magnoliaceae) through SNP marker [J]. Guihaia, 2012, 32(4): 542–547. doi: 10.3969/j.issn.1000-3142.2012. 04.022.王佳媛, 吳傳芳, 唐亞. 基于SNP分子標記的凹葉木蘭遺傳多樣性初步研究 [J]. 廣西植物, 2012, 32(4): 542–547. doi: 10.3969/j.issn. 1000-3142.2012.04.022.

[42] WANG Y S. Research progress of plant population genomics based on high-throughput sequencing [J]. Hereditas (Beijing), 2016, 38(8): 688– 699. doi: 10.16288/j.yczz.16-061.王云生. 基于高通量測序的植物群體基因組學研究進展 [J]. 遺傳, 2016, 38(8): 688–699. doi: 10.16288/j.yczz.16-061.

[43] NORDBORG M, HU T T, ISHINO Y, et al. The pattern of polymer- phism in[J]. PLoS Biol, 2005, 3(7): 1289–1299. doi: 10.1371/journal.pbio.0030196.

[44] CAICEDO A L, WILLIAMSON S H, HERNANDEZ R D, et al. Genome- wide patterns of nucleotide polymorphism in domesticated rice [J]. PLoS Genet, 2007, 3(9): 1745–1756. doi:10.1371/journal.pgen.003 0163.

[45] CHU Y G, SU X H. Research progress of single nucleotide polymer- phisms in forest trees [J]. Hereditas (Beijing), 2008, 30(10): 1272– 1278. doi: 10.3321/j.issn:0253-9772.2008.10.006.褚延廣, 蘇曉華. 單核苷酸多態性在林木中的研究進展 [J]. 遺傳, 2008, 30(10): 1272–1278. doi: 10.3321/j.issn:0253-9772.2008.10.006.

[46] HEUERTZ M, de PAOLI E, K?LLMAN T, et al. Multilocus patterns of nucleotide diversity, linkage disequilibrium and demographic history of Norway spruce [(L.) Karst] [J]. Genetics, 2006, 174(4): 2095–2105. doi: 10.1534/genetics.106.065102.

[47] TUSKAN G A, DIFAZIO S, JANSSON S, et al. The genome of black cottonwood,(Torr. & Gray) [J]. Science, 2006, 313(5793): 1596–1604. doi: 10.1126/science.1128691.

[48] CAMPOY J A, LERIGOLEUR-BALSEMIN E, CHRISTMANN H, et al. Genetic diversity, linkage disequilibrium, population structure and construction of a core collection ofL. landraces and bred cultivars [J]. BMC Plant Biol, 2016, 16: 49. doi: 10.1186/s12870-016- 0712-9.

[49] EMANUELLI F, LORENZI S, GRZESKOWIAK L, et al. Genetic diversity and population structure assessed by SSR and SNP markers in a large germplasm collection of grape [J]. BMC Plant Biol, 2013, 13: 39. doi: 10.1186/1471-2229-13-39.

[50] HAN H, WOESTE K E, HU Y H, et al. Genetic diversity and population structure of common walnut () in China based on EST-SSRs and the nuclear gene phenylalanine ammonia-lyase () [J]. Tree Genet Gen, 2016, 12(6): 111. doi:10.1007/s11295-016-1064-1.

[51] WU T, XIAO L J, CHEN S Y, et al. Transcriptomics and comparative analysis of threespecies;,and[J]. Plant Omics, 2015, 8(4): 361–371.

[52] NIELSEN R. Molecular signatures of natural selection [J]. Ann Rev Genet, 2005, 39: 197–218. doi: 10.1146/annurev.genet.39.073003.112 420.

Studies on Genetic Diversity ofCultivar Germplasms in Sichuan Based on RAD-SNPs Analysis

YAN Si-yu1*, ZHU Peng1*, GONG Wei1**, WANG Jing-yan1, WU Kai-zhi2, WU Chun-yan2, LI Hai-ping2, GONG Yi-hong2, DUAN Qiong2

(1. College of Forestry, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; 2. Forest Seedling Station of Sichuan Province,Chengdu 610081, China)

In order to understand the genetic diversity of walnut () in Sichuan, the genetic diversity and genetic structure of 42 walnut germplasms were analyzed by RAD-SNPs method. The results showed that a total of 70G clean data and 160 309 high consistent SNPs were obtained, and the average Q30 was 96.3%. Forty-two walnut genotypes could be divided into two main groups, such as AJR (group,=33) and AJS (group,=9). The high genetic differentiation (ST=0.285) between two groups had correlation with their geographic distribution. Meanwhile, the groups of three varieties of ‘Weibo No. 1’, ‘Bailong No. 1’ and ‘Shimianjuhe’ were adjusted. There were 9 and 14 varieties in AJS and AJR groups with pure blood, respectively, while the rests in AJS and AJR groups were mixed blood. There were high genetic diversity among 42 walnut germplasms with nucleotide diversity [P()] of0.029and expected heterozygosity () of0.286, and thegroup has higher genetic diversity thangroup. So, these would provide basis for the preservation and cross breeding of walnut germplasm resources in Sichuan.

RAD-SNP;;; Genetic diversity

10.11926/jtsb.3906

2018-03-15

2018-05-09

四川省林業廳種苗站項目(20140312)；四川省科技廳項目(2016NYZ0035, 2017NFP0051, 2017NFP0126)；四川省農業科技成果轉化項目(16NZ0067); 四川農業大學新農村發展研究院雅安服務總站項目(2017-05)資助

This work was supported by the Projects of Tree Seedling Station of Sichuan Forestry Department (Grant No. 20140312), and the Projects of Science and Technology Department of Sichuan Province (Grant No. 2016NYZ0035, 2017NFP0051, 2017NFP0126), the Project for Agricultural Science and Technology Achievements Transformation in Sichuan (Grant No. 16NZ0067), and the Project of Yaan Service Station of the Institute for New Rural Development, Sichuan Agriculture University (Grant No. 2017-05).

閆思宇(1993~ ), 女, 碩士研究生, 主要從事經濟林方面研究。E-mail: ysy4017@126.com

* 對本文有同等貢獻，并列第一作者

E-mail: gongwei@sicau.edu.cn