催吐蘿芙木離體培養和植株再生體系的建立

董佳穎，楊小田，向小群，郭晉雅，高峰

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催吐蘿芙木離體培養和植株再生體系的建立

董佳穎，楊小田，向小群，郭晉雅，高峰*

(華南師范大學生命科學學院, 廣州 510631)

為建立催吐蘿芙木(Afzel.)的快繁再生體系，以莖段為外植體，比較了植物生長調節劑對其愈傷組織誘導、分化及生根的影響。結果表明，誘導愈傷組織的適宜培養基為MS+2,4-D 1.0 mg L–1+TDZ 0.5 mg L–1或MS+2,4-D 2.0 mg L–1+TDZ 0.5 mg L–1，出愈率達100%且生長狀況良好；誘導叢生芽的最佳培養基為MS+6-BA 3.0 mg L–1+NAA 0.1 mg L–1,出芽率為46.6%，平均出芽數為3.04。這為催吐蘿芙木的快速繁殖和遺傳轉化研究奠定了基礎。

催吐蘿芙木；愈傷組織；再生；組織培養

蘿芙木為夾竹桃科(Apocnyaceae)蘿芙木屬()植物的總稱，是一類天然名貴的熱帶藥用植物。富含多種生物堿，如利血平、阿馬尼新、育亨賓等, 可以用于治療多種疾病[1–5]。蘿芙木屬植物共有135種和變種，我國產9種，比較重要的有中國蘿芙木()、云南蘿芙木()、催吐蘿芙木()和印度蘿芙木()[6]。

有研究表明，催吐蘿芙木的各項生長指標明顯高于其他蘿芙木物種。云南蘿芙木植株較小，生物產量低，利血平含量也低；印度蘿芙木植株中等, 生物產量也較多，利血平含量高[5]；催吐蘿芙木植株高大，生物產量多，利血平含量高；作為提取利血平的原料開發，應首選催吐蘿芙木和印度蘿芙木[7]。在國內催吐蘿芙木已用作提取利血平的原料，并將其制成治療高血壓的降壓靈(verticil)和降壓平(resemine)等藥品應用于臨床[8]。

然而，由于蘿芙木的種子繁殖出芽率低，生長緩慢，扦插繁殖生根困難[7]，無法用于大規模的生產。因此，采用離體培養蘿芙木無疑具有重要的理論和應用價值。目前，關于蘿芙木的組織培養僅在印度蘿芙木和云南蘿芙木中有報道[8–11]，而催吐蘿芙木的離體培養及植株再生尚未見報道。本文以催吐蘿芙木的莖段和葉片為外植體，通過比較不同植物生長調節劑對其愈傷組織誘導、分化及試管苗生根的影響，以建立催吐蘿芙木的離體培養植株再生體系，為催吐蘿芙木的快速繁殖及遺傳轉化奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

催吐蘿芙木(Afzel.)由華南師范大學生命科學學院周先葉副教授鑒定并提供, 種植于該校生物園內。

1.2 外植體的表面消毒

選取幼嫩莖段或幼葉作為外植體，用洗潔精浸泡和流水沖洗30 min后，蒸餾水沖洗2~3次，潔凈紗布吸干。用70%乙醇浸泡20 s后，用2%次氯酸鈉消毒7~8 min，再用無菌水沖洗5~8次。

1.3 愈傷組織的誘導

將消毒后的幼莖切成長度為5 mm的莖段，葉片切成0.5 cm×0.5 cm接種于含有不同植物生長調節劑組合的MS培養基上，在28℃黑暗培養。每3 d觀察1次，30 d統計出愈率=產生愈傷組織的外植體數/接種的外植體總數。每處理接種27個外植體，重復3次。

1.4 芽的分化誘導

將愈傷組織轉移到含6-BA (1.0~4.0 mg L–1)+ NAA (0.05~0.5 mg L–1)的MS培養基上，暗培養1周后轉為16 h d–1光照培養(光強2 000mol m–2s–1)。每3 d觀察1次，6周后統計出芽率=(分化出芽的愈傷組織數/接種的愈傷組織總數)×100%。

1.5 叢生芽的生根誘導

叢生芽生長至1~2 cm長時，切成單芽，扦插至含不同濃度NAA和IBA的1/2MS生根培養基中。4周后統計生根率和根的數量，篩選最適生根培養基。

1.6 煉苗移栽

將已生根試管苗的培養瓶蓋擰松(但不揭開), 自然光照2~3 d后再揭去瓶蓋。在自然光照下經過5~7 d練苗，將試管苗移栽入盛有營養土的培養缽中，并觀察成活情況。

2 結果和分析

2.1 愈傷組織的誘導

分別將外植體接種在含生長素類激素2,4-D、NAA、IBA和含細胞分裂素類激素6-BA或TDZ的MS培養基上，進行不同植物生長調節劑對愈傷組織誘導影響的單因素試驗。結果表明，幼莖切段在兩端的切口處能誘導產生愈傷組織(圖1: A)，但不同植物生長調節劑對愈傷組織的誘導效果不同(表1), 除IBA和6-BA外，2,4-D、NAA和TDZ均能誘導愈傷組織產生，且TDZ>2,4-D>NAA。

從表2可見，在2.0 mg L–12,4-D+0.5 mg L–1NAA，2.0 mg L–12,4-D+0.5 mg L–16-BA，1.0 mg L–12,4-D+0.5 mg L–1TDZ，2.0 mg L–12,4-D+0.5 mg L–1TDZ,2.0 mg L–16-BA+0.5 mg L–1NAA的培養基上，出愈率均為100%。外植體在2,4-D+TDZ組合的培養基中培養3 d，開始產生愈傷組織，一周后愈傷組織較明顯，三周后整個外植體基本被愈傷組織覆蓋,且愈傷組織生長狀況好，愈傷組織量大；在2,4-D+ 6-BA和2,4-D+NAA的組合中，外植體啟動愈傷組織發生的時間稍慢，一般為一周左右；而在6-BA+ NAA的組合中，愈傷組織易褐化。綜合考慮愈傷組織啟動時間、出愈率和愈傷組織生長情況, 誘導催吐蘿芙木產生愈傷組織的最佳培養基為MS+2,4-D 1.0 mg L–1+TDZ 0.5 mg L–1或MS+2,4-D 2.0 mg L–1+ TDZ 0.5 mg L–1。

2.2 6-BA與NAA配比對愈傷組織芽分化的影響

不同濃度6-BA與NAA配比對催吐蘿芙木誘導愈傷組織產生不定芽具有一定的影響(表3)。6-BA濃度對愈傷組織的不定芽分化的影響尤為明顯。隨6-BA濃度的增加，愈傷組織誘導不定芽的分化率也提高，但并不呈線性正相關。同時，6-BA/NAA對愈傷組織分化出芽有明顯影響，比值低時促進愈傷組織生長，抑制芽的分化，分化的芽矮小畸形; 隨6-BA/NAA比值的增加，芽分化率也逐漸增大，愈傷組織也由原來的黃白色逐漸變為綠色，表面芽點突出；當6-BA/NAA比值達到30時，芽的數量和生長狀態為最佳(圖1: B)。

表1 植物生長調節劑對愈傷組織誘導的影響

表2 植物生長調節劑組合對催吐蘿芙木愈傷組織誘導的影響

2.3 試管苗的生根培養與煉苗

不定芽在添加NAA的培養基中培養1周后, 基部分化出不定根(圖1: C)，同時，隨NAA濃度增加生根率和生根數呈先升高后下降的趨勢；NAA濃度為0.1 mg L–1時，生根數量少，長出的根細而長; NAA濃度為0.5 mg L–1時，生根數量多，且根粗而短；NAA濃度達到1.0 mg L–1時，生根率下降到60%;當NAA濃度為2.0 mg L–1時，生根率僅為13.3%。這說明低濃度的NAA利于生根，而高濃度的NAA對生根具有抑制作用。從生根數和根的生長情況來看，IBA對試管苗根的誘導效果較NAA差。當IBA濃度為0.5~1.0 mg L–1時，能不同程度誘導生根, 但根數量少，且比較細長。兩種生長素等比例混合對根的誘導效果并沒有表現出疊加效應，甚至與單一生長素相比，產生根的數量更少，誘導效果更差。因此，綜合生根率、生根數和根生長情況來看，催吐蘿芙木生根培養的最佳培養基為1/2MS+NAA 0.5 mg L–1，生根率達100%，且根的生長狀態最佳, 從而形成完整的再生植株(圖1: D)。選擇生長健壯、株高、莖粗和木質化程度高的完整再生植株進行煉苗(圖1: E)，然后將再生植株移栽至土壤，幼苗成活且生長狀態良好(圖1: F)。

表3 6-BA與NAA配比對不定芽誘導的影響

3 討論

植物生長調節劑在植物離體培養中起著啟動愈傷組織形成和芽、根的分化等作用，其種類和配比是影響愈傷組織產生和分化的主要因素。其中生長素具有促進細胞增殖和促進生根等生理作用，細胞分裂素具有引起細胞分裂，誘導芽的形成和促進芽的生長等生理作用。蘿芙木屬植物愈傷組織誘導中，常用的生長素是2,4-D和NAA，細胞分裂素是6-BA。印度蘿芙木愈傷組織誘導使用的是6-BA和NAA組合[8]；而云南蘿芙木愈傷組織誘導使用的是2,4-D和6-BA組合[11]。本研究結果表明，2,4-D和TDZ單獨使用對催吐蘿芙木莖段愈傷組織的啟動效果優于NAA、IBA和6-BA，且2,4-D與TDZ或6-BA的組合效果更佳；其中2,4-D與TDZ是誘導催吐蘿芙木愈傷組織形成的最佳組合，啟動愈傷組織的時間快且出愈率高。從芽的分化誘導來看，云南蘿芙木不定芽誘導的最佳培養基是MS+6-BA 3.0 mg L–1+NAA 0.05 mg L–1[11]；印度蘿芙木則為MS+6- BA 1.0 mg L–1+NAA 0.1 mg L–1[8]；而催吐蘿芙木則是MS+6-BA 3.0 mg L–1+NAA 0.1 mg L–1。這說明蘿芙木屬不同物種的愈傷組織誘導和分化所需的植物生長調節劑種類和濃度存在一定的差異。

云南蘿芙木用葉片，而印度蘿芙木用腋芽、葉片和頂芽都可成功誘導愈傷組織產生和分化，并獲得再生植株[8–11]。本文采用2,4-D與TDZ或6-BA組合可誘導催吐蘿芙木葉片產生愈傷組織，但經過幾個月的培養仍未分化。高燕等[11]對印度蘿芙木組織培養的研究表明，葉片容易產生愈傷組織，但再分化能力較差，這與本研究結果相一致。而以云南蘿芙木的葉片作為外植體誘導的愈傷組織可正常分化，并獲得再生植株[8]。這可能是由于蘿芙木不同物種或不同組織對植物生長調節劑的敏感度不同所致，但具體原因尚需進一步研究。

此外，蘿芙木離體培養技術除了可用于快速繁殖外，還可用于作為基因工程技術的受體系統，通過根癌農桿菌或發根農桿菌介導外源基因到蘿芙木組織內，進行品種改良與器官再生[12–15]，培育出優良高產的催吐蘿芙木新品種。本文所建立的催吐蘿芙木組織培養及植株再生體系將為其遺傳轉化奠定重要的技術基礎。

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Culture and Establishment of Rapid Regeneration System of

DONG Jia-ying, YANG Xiao-tian, XIANG Xiao-qun, GUO Jin-ya, GAO Feng*

(School of Life Sciences, South China Normal University,Guangzhou 510631, China)

To constructe the rapid regeneration system of Rauvolfia vomitoriaAfzel., the effects of plant growth regulators on callus induction, differentiation, and rooting were studied with young stems as explants. The results showed that the optimal medium for callus induction was MS+2,4-D 1.0 mg L–1+TDZ 0.5 mg L–1or MS+2,4-D 2.0 mg L–1+TDZ 0.5 mg L–1with callus induction rate of 100%. The optimal medium for callus differentiation was MS+6-BA 3.0 mg L–1+NAA 0.1 mg L–1with shooting rate of 46.6% and average buds of 3.04. So, these would lay a foundation for studying on rapid regeneration and genetic transformation of R. vomitoria.

Afzel.; Callus; Regeneration; Tissue culture

10.11926/jtsb.3935

2018-04-25

2018-07-04

國家自然科學基金項目(31171601)資助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31171601).

董佳穎(1994~ )，女，碩士研究生，主要從事植物遺傳調控研究。E-mail: ddongjiaying@163.com

E-mail: peak0041@vip.sina.com