小鼠局部淋巴結實驗(BrdU-ELISA)在25%氰氟草酯乳油皮膚致敏性檢測中的應用

秦 珩，程 潔，靳蘇香，錢 雯，章 婉，嚴 婷，董 昊，張成香，張璐璐，王玉邦, ，環 飛*

(1. 江蘇省醫藥農藥獸藥安全性評價與研究中心，南京 211166；2. 南京醫科大學公共衛生學院，南京 211166)

反復接觸農藥可能導致皮膚致敏反應，皮膚出現紅斑、水腫、丘疹、焦痂、瘙癢等體征的變態反應性接觸性皮炎(allergic contact dermatitis, ACD)。ACD是有關農藥生產、使用者的健康與職業衛生重要問題。目前評估農藥皮膚致敏性的方法是豚鼠實驗，主要包括豚鼠局部封閉涂皮實驗(Buehler test, BT法)和豚鼠最大值實驗(guinea pig maximisation test, GPMT)，但動物使用數量多，時間長達30天，結果受主觀影響，近年來發展小鼠局部淋巴結分析實驗(local lymph node assay，LLNA)，LLNA方法的實現了小動物替代大動物，動物使用量減少，結果更加客觀，已被國家標準采納為標準實驗方法[1]。但該方法需要使用3H或125I放射性同位素、特殊儀器以及同位素實驗室等條件，還可能污染環境和實驗人員暴露風險，推廣作為農藥致敏性常規檢測相對困難。通過BrdU標記示蹤和酶聯疫吸附(ELISA)法測定細胞增殖已被廣泛應用各種實驗[2-4]，本次實驗方法采用ELISA檢測技術，提高實驗的靈敏性，同時避免放射性同位素摻入法的放射性污染，推廣在農藥致敏性評價中應用靈敏、短期且無污染的安全性評價方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級、9周齡(初始體重19.8～24.8 g)、30只雌性BALB/c小鼠[5]，由揚州大學比較醫學中心提供[SCXK (蘇) 2017-0007]，合格證編號：201712819。動物飼養于南京醫科大學衛生分析檢測中心動物屏障設施中[SYXK (蘇) 2015-0009]，實驗動物使用符合實驗動物倫理委員會審查的要求。動物實驗符合3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

AOO(丙酮∶橄欖油=4∶1，上海凌峰化學試劑有限公司、益海嘉里食品營銷有限公司)、超純水(美國Millipo公司密理博純水儀自制)、BrdU(Sigma公司)、BrdU-ELISA試劑盒(Abcam公司)、pH 7.0無鈣鎂磷酸鹽緩沖液(PBS，HyClone)。電子天平(T1000型、常熟市雙杰測試儀器廠)，酶標儀(SpectraMax/M2e、美谷分子儀器(上海)有限公司)，CO2培養箱(Heracell-150、德國賀利氏公司)，超凈工作臺(SW-CJ-2FD、蘇州凈化設備有限公司)，倒置顯微鏡(CK41、日本Olympus公司)，離心機(DD-5M、上海盧湘儀離心機儀器有限司)，游標卡尺(0 ～ 150 mm、上海美耐特實業有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與染毒

將30只BALB/c小鼠，隨機分為6組，每組5只。氰氟草酯乳油設3個(100%、50%、25%)濃度組，受試樣品采用橄欖油稀釋，采用同時設陰性對照組(橄欖油)、設陰性對照組(AOO)及陽性對照組(25%已基肉桂醛，采用AOO溶解)。小鼠耳背涂抹25 μL受試物，每天1次給樣，連續3 d，第6天給小鼠腹腔注射BrdU(溶劑PBS，5 mg/只)，24 h后處死小鼠。

1.3.2 耳厚測定

記錄實驗開始和結束時的耳厚度。

1.3.3 耳重測定

實驗結束采用打孔器取下直徑8 mm耳片，稱重。

1.3.4 淋巴結重量與細胞懸液的制備

取雙側耳后淋巴結并稱重；200目篩網研磨制備單細胞懸液，將細胞轉移到15 mLPBS。

1.3.5 Brdu-ELISA測定

將100 μL細胞懸液加入到平底96孔板，每只動物3個平行孔。1200 r/min離心10 min，棄上清后烘干培養板，每孔加入固定液200 μL，室溫固定30 min后離心棄固定液，加入anti-BrdU抗體溶液100 μL，室溫孵育1 h后離心棄抗體溶液，加入洗滌液200 μL清洗抗體溶液，離心棄洗滌液，清洗3次，加入TMB底物溶液100 μL，常溫、避光孵育15 min，酶標儀波長450 nm，測量吸光度。

1.4 統計學方法

計算刺激指數(SI)：SI1為實驗組淋巴結重量平均值與對照組淋巴結重量平均值的比值；SI2為實驗組發(吸)光值平均值與對照組發(吸)光值平均值的比值。采用統計軟件SPSS 22.0計算均數與標準差，小鼠體重采用多組間比較用單因素方差分析，組間比較及多組與對照組比較用Dunnett-t檢驗，檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 體重

結果顯示各劑量組各觀察點的小鼠體重與對照組比較，差異均無顯著性(P> 0.05)(未列圖表)。

2.2 耳厚度和耳重

結果顯示，各劑量組的耳染毒區未觀察到明顯紅斑、水腫，耳厚度增加和耳重均不超過對照組的25%。

2.3 淋巴結重量

由表1結果顯示，實驗組、陰性對照組和陽性對照組的淋巴結重量變化情況，溶劑和空白對照組的刺激指數SI1<1.6，陽性對照組(25%肉桂醛)的刺激指數SI1>1.6，實驗系統可靠；25%氰氟草酯乳油低、中、高劑量組的刺激指數SI1<1.6，無劑量反應關系。

2.4 BrdU含量測定

由表1結果可見，實驗組、陰性對照組和陽性對照組的BrdU含量變化情況，溶劑和空白對照組的刺激指數SI2<1.6，陽性對照組(25%肉桂醛)的刺激指數SI2>1.6，實驗系統可靠；25%氰氟草酯乳油低、中、高劑量組的刺激指數SI2<1.6，無劑量反應關系。

3 討論

2009年劉珍等[6]對實驗方法改進，增加刺激指標如耳厚和耳重的檢測，2010年OECD增加了LLNA：BrdU-ELISA(TG442B)通過ELISA方法測定淋巴細胞增殖情況替代放射性同素的檢測[7]。2013年陽曉燕等增加了刺激指標(耳厚差、耳重)，致敏性指標(淋巴結重量，淋巴細胞計數，ATP與熒光素反應后的發光強度)[8]。本次實驗我們也相應增加刺激指標與致敏性指標，有利于更好判斷是農藥直接作用造成的刺激反應，還是變態反應。并通過定量測定小鼠引流淋巴結細胞的BrdU摻入量，分析小鼠耳部皮膚局部涂抹農藥后，相應耳后引流淋巴結的淋巴細胞的增殖情況判定農藥致敏性。本方法的25%氰氟草酯乳油致敏性結果SI1和SI2均小于1.6，結果為陰性，與本實驗室的采用傳統方法檢測的結果一致。

小鼠局部淋巴結(BrdU摻入法)實驗是用小鼠替代豚鼠的實驗方法，每組最少可以使用4只小鼠，明顯減少了實驗動物數量；并以體積小的動物代替體積大的動物；并且實驗周期僅7 d時間，大量節約動物設施的使用面積、時間、耗能；改進了實驗結果的測量方法，酶標儀定量檢測使結果更加客觀科學，避免傳統實驗肉眼觀察皮膚反應評分帶來的主觀性，實現了3R原則(減少、優化與替代)[9]。2010 年替代方法驗證多機構協調委員會(ICCVAM)采納LLNA：BrdU-ELISA作為皮膚致敏性的替代方法[10]。冼靜雯[11]等采用BALB/c小鼠 LLNA:BrdU-ELISA對多種化學物研究表明，該法陽性預測率為 90%、陰性預測率為 100%、假陽性率為 17%、假陰性率為 0、靈敏度為 100%、特異度為 83%、準確度為 93%。因此，高靈敏度，省時，省力，費用低的LLNA：BrdU ELISA有必要在我國農藥致敏性常規檢測領域推廣。

表1 淋巴結重量與BrdU的測定結果Table 1 Determination of lymph node weight and BrdU staining