恒河猴與食蟹猴血清多重細胞因子檢測及分析

黃樹武，王 靜，陳梅玲，羅銀珠，潘金春，吳瑞可，何麗芳，閔凡貴

(廣東省實驗動物監測所，廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510663)

非人靈長類(non-human primates)實驗動物是生物醫學研究中不可替代的重要資源，被廣泛應用于人類疾病的模型研究、疫苗與藥物的臨床前評價[1-3]，是研究HIV感染、免疫和病理的首選動物模型[4-7]。隨著非人靈長類實驗動物飼養繁育規范化程度提高及動物福利的不斷加強，非人靈長類實驗動物的標準化程度也越來越高。

在生物醫學研究工作中，使用量最多的非人靈長類實驗動物是舊大陸猴，其中以恒河猴和食蟹猴為主。早期研究報告分別對恒河猴和食蟹猴之間關于血液生理和生化指標[8-9]、紅細胞免疫黏附功能[10]、血液蛋白遺傳多樣性[11]、生產繁殖性能[12-13]等生物學特性進行測定和分析，獲得了重要的基礎數據，證實恒河猴與食蟹猴雖然存在某些參數的差異，但總體種屬差異性不大。然而，目前國內尚無關于正常食蟹猴與恒河猴細胞因子比較的報道，國外也鮮有報道。本研究將采用高通量xMap技術測定恒河猴與食蟹猴血清多重細胞因子的濃度，并分析恒河猴與食蟹猴間差異，為生物醫學研究提供基礎數據。

表1 選擇的因子信息Table 1 Information of the selected cytokines

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級恒河猴15只，年齡3.0～4.0歲，其中雄性7只，體重5.0～6.0 kg，雌性8只，體重4.3～5.5 kg，由從化華珍實驗動物養殖場提供[SCXK (粵) 2015-0028]，結核菌素試驗陰性，排除猴B病毒、猴免疫缺陷病毒、猴逆轉錄D型病毒和猴T淋巴細胞趨向性病毒I 型。該機構獲得了國際AAALAC完全認證，其動物飼養和實驗操作在從化華珍實驗動物養殖場實驗設施[SYXK (粵) 2015-0151]，符合動物福利和倫理要求，并按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

普通級食蟹猴15只，年齡3.0～4.0歲，其中雄性7只，體重3.5～4.5 kg，雌性8只，體重2.5～3.5 kg，由廣東春盛生物科技有限公司提供[SCXK (粵) 2014-0027]，結核菌素試驗陰性，排除猴B病毒、猴免疫缺陷病毒、猴逆轉錄D型病毒和猴T淋巴細胞趨向性病毒I 型。該機構獲得了國際AAALAC完全認證，其動物飼養和實驗操作在廣東春盛生物科技有限公司實驗設施[SYXK (粵) 2015-0152]，符合動物福利和倫理要求，并按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

液相芯片，由R&D Systems生產，包括2個反應體系，體系1同時測定37種細胞因子(Lot Number: L122018)，體系2同時測定6種細胞因子(Lot Number: L122016)，具體信息見表1。流式細胞儀(BD/FACSCanto 2，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 血清采集

采用非抗凝真空采血管自后肢小隱靜脈或前肢皮下頭靜脈采集血液1～2 mL，4℃冰箱過夜，3000 r/min離心15 min，取上清液，-80℃條件保存。

1.3.2 細胞因子檢測

利用流式細胞儀(BD/FACSCanto 2，美國)，采用xMap技術測定血清中43種細胞因子的濃度。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 細胞因子檢測分析

所測29種細胞因子按其在感染免疫中的作用，可分為促炎癥因子、抑炎癥因子、多能細胞因子和其他功能細胞因子，測定結果見表2。其中，19種細胞因子測定結果呈正態分布，F檢驗結果顯示有2種細胞因子方差不齊；10種細胞因子測定結果呈偏態分布。

恒河猴與食蟹猴比較，11種促炎癥因子中，僅IL-15存在顯著性差異(P﹤0.05)；12種抑炎癥因子中，3種細胞因子(IL-1RA、IL-6R α和sCD27)存在顯著性群體間差異(P﹤0.05)；其他細胞因子無群體間差異(P﹥0.05)。

2.2 趨化因子檢測分析

14種趨化因子的測定結果見表3，其中，11種趨化因子呈正態分布，1種趨化因子F檢驗結果顯示方差不齊；3種趨化因子呈偏態分布。

恒河猴與食蟹猴比較，僅CCL5/RNATES存在群體間差異(P﹤0.05)。

3 討論

細胞因子具有極強的生物學活性，在生物醫學研究中具有重要的意義[14-16]，一方面，可作為藥物用于臨床許多疾病的治療，另一方面，細胞因子在體內具有重要的病理作用。在感染、炎癥、自身免疫病、免疫缺陷疾病等狀態下，部分細胞因子明顯變化，通過檢測血清、血漿或組織液中細胞因子含量，可以對疾病診斷和治療做出相應評價，具有重要的臨床應用價值。而基礎血清、血漿和組織液中細胞因子的水平成為衡量病理狀態下細胞因子變化的重要的參考值，是首當其沖要解決的問題。

盡管實驗猴的使用數量越來越多，應用范圍越來越廣，但是其基礎生物學特性數據的研究卻相對滯后，作為實驗猴生產和出口大國，目前，我國尚無關于恒河猴與食蟹猴基礎細胞因子水平的研究。本研究采用高通量luminex xMap技術測定了恒河猴與食蟹猴43種血清細胞因子的水平，并進行了群體間比較。結果顯示，恒河猴與食蟹猴間僅5種細胞因子存在顯著性群體間差異，表明兩種猴群體間差異不大。本研究選擇的43種細胞因子與感染免疫、腫瘤免疫及自身免疫性疾病相關，提示恒河猴與食蟹猴具有相似的免疫基礎，基于兩種實驗猴開展免疫研究具備較高的可比性。

表2 細胞因子濃度測定結果及比較分析Table 2 Concentrations of detected cytokines and analysis of inter-group differences

備注： *采用Mann-Whitney test，△采用矯正t檢驗，其他參數采用隨機t檢驗.
Note. *Mann-WhitneyU-test.△Adjustedt-test. Other parameters used the randomt-test.

表3 趨化因子濃度測定結果及比較分析Table 3 Concentrations of detected chemokines and analysis of inter-group differences

備注：*采用Mann-Whitney test，△采用矯正t檢驗，其他參數采用隨機t檢驗.
Note. *Mann-WhitneyU-test.△Adjustedt-test. Other parameters used the randomt-test.

綜上，本研究探討了恒河猴與食蟹猴血清多重細胞因子水平，證實兩種猴基礎細胞因子水平差異小，可為生物醫學研究提供基礎數據，彌補現有資料的不足。